一個(gè)實(shí)驗(yàn)是：蛋白的免疫熒光顯影

一個(gè)實(shí)驗(yàn)是：細(xì)胞96孔板加藥

一個(gè)教程：設(shè)計(jì)引物軟件使用

一個(gè)實(shí)驗(yàn)：挑單克隆養(yǎng)菌

一個(gè)簡易教程：純蛋白大致步驟

洗一抗（千分之一tween＋TBST）

mTOL通路：促合成 促進(jìn)細(xì)胞增殖 抑制細(xì)胞凋亡

AmPK通路：促分解 促進(jìn)細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞增殖

細(xì)胞狀態(tài)不好時(shí)，AmPK會(huì)被激活，被激活的方式是磷酸化，此時(shí)抑制mTOL

加某種糖AmPK會(huì)被激活，細(xì)胞增殖會(huì)被抑制，目的想知道加糖之后是否有非AmPK抑制途徑

GAPDH：內(nèi)參蛋白（還有很多內(nèi)參蛋白，之所以能成為內(nèi)參蛋白，是因?yàn)榈鞍琢繜o論什么條件 幾乎不會(huì)改變 因?yàn)槭枪羌艿鞍祝?/span>

細(xì)胞稀釋 T25 25cm2 96孔板100 μL 熒光 三組平行實(shí)驗(yàn) 加糖 加抑制劑 + ++ 不加

千分之一tween＋TBST

蛋白的免疫熒光顯影原理

二抗 anti-rabbit IJJ HRP linked 1μL（也是用TBST稀釋1：5000）1h 室溫

1.DMEM(+++) 500mL+血清+雙抗

2.血清FBS Fetal Bovinr Serum滅活：4℃化凍2-3天至完全化開→58℃水浴35min→冷卻至室溫→放4℃→不用的分裝50mL稍多一些 封口膜 凍-30℃

3.雙抗Penicillin Streptomycin 100× 加5mL

96孔板取出平衡到室溫30min-1h→加100 μL Kate？混合液到96孔板，微孔板恒溫震蕩儀shaker搖2min→暗處避光反應(yīng)10min→酶標(biāo)儀測定

管放盒子里 121℃ 20min 高壓滅菌鍋中

培養(yǎng)基中要加藥或者別的東西都需要用濾器過濾膜除細(xì)菌

培養(yǎng)基 990mL+10 mL A糖

培養(yǎng)基 990mL+10 mL B抑制劑

培養(yǎng)基 990mL+10 mL A糖+10 mL B抑制劑

shake

吸走原先培養(yǎng)基（套小槍頭貼壁吸）

加入100 μL新培養(yǎng)基（貼壁加）

1.回收二抗（沒有沉淀可以繼續(xù)用）下次用可以補(bǔ)1 μL 二抗

2.用TBST 洗3次，每次10min（要比一抗洗久一點(diǎn)）

剪角 放入5%牛奶 室溫封閉1h

1.準(zhǔn)備顯影AB液 HRP Substrate，1:1混合 各0.5mL，取完放回4℃

2.儀器：Tanon 化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)

3.將顯影液（一定要均勻）鋪開

4.膜正面朝上，放之前要將膜正反都在顯影液上多涮幾次 推進(jìn)去

5.點(diǎn)發(fā)光拍攝→長曝光→Scheme1→拍攝→保存

6.點(diǎn)merge發(fā)光合成，可以顯示marker

7.內(nèi)參蛋白 GAPDH

→用小槍頭挑一個(gè)小點(diǎn)，把槍頭打進(jìn)培養(yǎng)基，37℃晃一晚上

→LB培養(yǎng)基配方：

1. Tryptone：10g

2.Yeast Extract：5g

3.NaCl：10g

4.Agar瓊脂粉：15g(固體培養(yǎng)基)

5.去離子水補(bǔ)至1000 mL

6.滅菌：蓋子擰松，121℃ 20min 高壓滅菌鍋，打開滅菌鍋的一剎那把蓋子擰緊

1.板子上的菌挑出

2.50 mL搖過夜

3.全部倒入1L培養(yǎng)基 搖3h OD值0.6-0.8

4.加誘導(dǎo)劑ITTJ 500μL（一般配1 M按2000×用）

5.溫度時(shí)間取決于蛋白性質(zhì)