一、檢測服務(wù)信息

1、檢測方法：SYBR Green染料法

2、分析方法：相對定量

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二、實驗主要材料

1、主要儀器

2、主要試劑

三、實驗操作

1、總RNA抽提

1）樣品前處理

組織樣本：

取約100 mg樣品至冷凍研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)移至裝有1 mL RNAiso Plus的1.5mL離心管中，振蕩混勻后室溫靜置約5min。

2）相分離

每1mL RNAiso Plus加入0.2mL氯仿，振蕩混勻15s后室溫靜置約3min，4℃，12000rpm，離心15min。

3）沉淀

轉(zhuǎn)移水相至新的1.5mL離心管中，每1mL RNAiso Plus加入0.5mL異丙醇，混勻后室溫靜置10min，4℃，12000rpm，離心10min。

4）洗滌

棄上清，每加入1mL75%的乙醇，混勻后4℃，7500rpm，離心5min。

5）溶解

棄上清，空氣干燥RNA沉淀約5min（注意不要完全干燥，只需沉淀泛白即可），加入適量的DEPC處理水溶解RNA沉淀。

6）測定濃度和純度

用分光光度計測定RNA濃度和純度后記錄數(shù)據(jù)。

2、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

1）按照下列組分配制RT反應(yīng)液（反應(yīng)液制備請在冰上進行）。為了保證反應(yīng)液配制的準確性，減少分裝造成的誤差，應(yīng)按照比實際用量稍大的體積配制反應(yīng)液，最后加入RNA樣品。

2）按如下程序進行反轉(zhuǎn)錄：

37℃,15min；85℃，5sec。

-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

3、定量PCR檢測

1）將Mix在4℃下融解，輕柔地上下顛倒混勻并進行短暫離心。

2）冰上配制下表中的反應(yīng)液

3）將反應(yīng)管進行短暫離心，確保所有反應(yīng)液在反應(yīng)孔底部。

4）采用三步法程序進行反應(yīng)：

四、相對定量△△Ct分析原理和方法

1、熒光信號理論方程

Rn?= RB?+ X0?(1+ E)n?Rs

第n次PCR循環(huán)時的熒光信號強度(Rn)等于背景信號強度(RB)加上每個分子的熒光強度(即單位熒光強度RS)與分子數(shù)目的乘積。

或總信號=本底信號+分子數(shù)量′單位信號強度

其中，Rn為第n個循環(huán)時的總信號，RB為本底信號，RS為單位信號強度，X0為起始模板數(shù)量，E為PCR效率。

2、公式推算

當(dāng)循環(huán)次數(shù)n=Ct值時，假設(shè)E=100%時：

RCt=RB+X0×2CtRs

X0×2Ct=(RCt-RB)/Rs=b

X0=b/2Ct=b×2-Ct

3、內(nèi)參基因均一化樣本差異

每個樣品都檢測目的基因和內(nèi)參基因，用內(nèi)參基因做均一化處理，校正各樣品在核酸數(shù)量上的差異，校正值=目的基因/內(nèi)參基因，即X1/X2=2-(Ct1-Ct2)?=2 -△?Ct

2 -△?Ct即表示為每個樣品中目的基因經(jīng)過均一化處理后的分子數(shù)量。

4、處理樣品和對照樣品比較

比較不同樣品間某個基因的表達量差異，相對值=處理樣品/對照樣品

即倍數(shù)變化為2 -△?Ct1/2 -△?Ct2 = 2 - △?△?Ct

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五、實驗結(jié)果

實驗原始數(shù)據(jù)見文件夾“原始數(shù)據(jù)”；引物信息、上機排版及檢測結(jié)果詳見提供的Excel表格“檢測結(jié)果”。

六、項目內(nèi)容

公眾號：如期生物

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