歐易單細胞文章繼續(xù)高分文章產(chǎn)出！2021年12月29日，重慶陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院張曦教授團隊在Clinical and Translational Medicine（IF 11.492）發(fā)表關(guān)于單細胞圖譜解析人間充質(zhì)干細胞異質(zhì)性的相關(guān)報道，該篇文章中，王崢老師為該篇文章的第一作者，歐易生物提供了該篇文章的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序和分析工作。下面我們一起學(xué)習(xí)這篇文章的具體內(nèi)容。

?基本信息?

材料：正常骨髓（3例），脂肪（3例），臍帶（2例），真皮（3例）

期刊：Clinical and Translational Medicine

發(fā)表時間：2021年12月

方法：歐易生物10× Genomics scRNA-seq

?研究背景和研究目的?

間充質(zhì)干細胞 (mesenchymal stem cells, MSCs)?在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用具有廣闊前景。然而，MSCs的異質(zhì)性，包括來自供體、組織、亞群和單個細胞的差異，阻礙了MSCs在基礎(chǔ)研究和臨床中的應(yīng)用。同時，MSCs的細胞外基質(zhì) (Extracellular matrix, ECM)?在支架結(jié)構(gòu)、免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要作用，但尚不清楚ECM對MSCs異質(zhì)性的影響。因此，這篇文章旨在通過單細胞測序解析MSCs異質(zhì)性以及ECM對其異質(zhì)性的功能貢獻，為促進MSCs的質(zhì)量控制和治療策略提供理論基礎(chǔ)。

?內(nèi)容概述?

作者從11個健康供體的樣本中獲得約130,000個細胞，構(gòu)建了不同組織的MSCs單細胞圖譜。對MSCs進一步分析研究，發(fā)現(xiàn)組織特異性以及具有保守性的MSCs亞群，ECM在MSCs異質(zhì)性中起到?jīng)Q定作用。此外，ECM相關(guān)的炎癥、衰老、抗原處理和呈遞等功能在組織特異性亞群中也是高度異質(zhì)性的。擬時序分析進一步說明MSCs組織內(nèi)以及不同組織間的異質(zhì)性。發(fā)育軌跡的構(gòu)建也說明了MSCs組織間和組織內(nèi)的異質(zhì)性。

?具體研究內(nèi)容解析?

1.?利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析組織特異性MSCs亞群及其基因表達特征

作者首先從四類組織中提取了MSCs，并利用三系分化和流式鑒定所提取細胞，之后利用流式分選MSCs進行單細胞測序，得到超過130,000個細胞，構(gòu)建了一個來自11名健康捐贈者 (年齡22歲至46歲) 以及多個組織 (骨髓、脂肪、臍帶和真皮) 的MSCs單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜 (Figure 1A)。捕獲到的MSCs降維聚類后得到12個cluster (Figure 1B)，各個cluster具有轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性 (Figure 1C)。同時將樣本信息映射到降維聚類結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)MSCs亞群的多樣性具有組織依賴性的特點 (Figure 1D)。為了更好地描述MSCs亞群的特性，作者定義組織特異性群 (其中一個組織的相對豐度在該群中占90%)，其他群被定義為組織保守群。對組織特異性和組織保守性MSCs亞群進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)各個亞群各自具有組織特異性或較為保守的特點 (Figure 1E)。其中C0：BMSC特異性；C2, C3：AMSC特異性；C4：UMSC特異性；C5, C7, C9：DMSC特異性，各組織特異性亞群marker gene如圖Figure 2A-D所示。

針對MSCs各亞群做差異基因的功能富集分析，富集到的GO條目主要分為三類：(1) ECM, (2) cell cycle regulation, (3) cytokine/chemokine (Figure 2E)。使用TRRUST對所有TFs進行調(diào)控活性分析，以解析每個亞群內(nèi)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，作者還根據(jù)文獻報道人工注釋TFs在免疫調(diào)節(jié)和譜系分化中的作用。不同MSCs亞群由不同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，例如C3亞群主要由JUN、SP1和DDIT3調(diào)控，這表明成骨分化可能優(yōu)先，其他譜系分化可能受到抑制 (Figure 2F)。

Figure 1. 單細胞測序分析MSCs亞群組織特異性

Figure 2. MSCs組織特異性亞群的特征

2.?ECM相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)基因在組織特異性MSCs亞群中具有高度異質(zhì)性

MSCs的ECM通過細胞因子分泌調(diào)節(jié)免疫細胞遷移和分化，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答微環(huán)境。通過ECM相關(guān)的條目研究ECM異質(zhì)性與細胞因子分泌之間的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ECM相關(guān)蛋白和分泌因子在組織特異性亞群中的異質(zhì)性明顯高于保守亞群（Figure 3A-C）。除了趨化因子外，整合素和微纖絲相關(guān)蛋白（microfibrillar-associated proteins，MFAPs）在不同的亞群中功能也不同，以趨化劑或改變免疫細胞的行為起作用（Figure 3B）。除了免疫抑制特性外，MSCs還可以分泌炎癥因子，增強其免疫刺激能力（Figure 3C-D）。所有組織特異性亞群均有異質(zhì)性分泌較高的炎癥蛋白，例如C0中分泌IL7、CXCL16；C2和C3中分泌HMGB1、HMGB3。

Figure 3.ECM相關(guān)通路和抗炎相關(guān)高表達基因

3.?抗原處理復(fù)合物在MSCs保守性亞群和組織特異性亞群中的異質(zhì)性

免疫反應(yīng)的啟動是由抗原加工和呈遞介導(dǎo)的，ECM重塑是其中一個關(guān)鍵步驟，例如，與抗原處理和呈遞相關(guān)的MHC I類和II類介導(dǎo)ECM中的炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了解ECM異質(zhì)性如何影響抗原加工和呈遞，作者首先研究了保守性和組織特異性MSCs亞群中與抗原加工和呈遞相關(guān)的差異基因。研究表明，在抗原加工和呈遞過程中，與表面抗原、熱休克蛋白家族和蛋白酶體26S亞單位相關(guān)的三種功能模塊在基因表達上表現(xiàn)出異質(zhì)性（Figure 4A）。這些差異基因在外源性肽抗原加工和呈遞等三個GO條目中富集（Figure 4B）。功能復(fù)合物，例如PA700-20S-PA28蛋白酶體復(fù)合物，在BMSC特異性C0亞群、AMSC特異性C2亞群和保守性C6亞群中富集，從而促進抗原加工（Figure 4C）。綜合以上的分析結(jié)果來看，UMSC特異性C4亞群和保守性C8亞群具有較弱的抗原加工處理和呈遞能力。

Figure 4. 深度分析轉(zhuǎn)錄組中與抗原加工和呈遞相關(guān)的基因表達

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4.?與衰老相關(guān)的ECM蛋白在組織特異性MSCs亞群中表現(xiàn)出異質(zhì)性

表現(xiàn)出衰老相關(guān)分泌表型 (senescence associated secretory phenotype, SASP) 的衰老MSCs會過度分泌促炎因子，從而干擾其對免疫抑制能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，與衰老相關(guān)的基因表達呈現(xiàn)異質(zhì)性。相對于其他保守性和組織特異性MSCs亞群來說，許多抗衰老基因在UMSC和DMSC的特異性亞群中高表達 (Fig. 5A)。此外，衰老下調(diào)的ECM基因在UMSC和DMSC特異性亞群中高表達，而衰老上調(diào)的ECM基因在幾個亞群中表達相對較低，其中UMSC特異性C4亞群在衰老上調(diào)的ECM基因中表達最低 (Figure 5B)。有研究發(fā)現(xiàn)，核糖體基因的保護是防止細胞衰老的關(guān)鍵，在衰老過程中，啟動子區(qū)域核糖體RNA基因的甲基化增加，從而降低基因表達。

作者在該研究中發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白在UMSC和DMSC特異性亞群中高表達，尤其是在C4中 (Figure 5C)。PPI分析顯示這些核糖體蛋白之間表現(xiàn)出高度的相互作用 (Figure 5D)?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明UMSC和DMSC特異亞群 (C4、C5、C6和C7) 在抗老化方面具有優(yōu)勢。為了進一步證明這一分析結(jié)果，作者使用β-gal染色檢測MSCs在P6的衰老程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與UMSC和DMSC相比，AMSC和BMSC中SA-β-gal-陽性MSCs的百分比顯著增加 (Figure 5E, F)。作者同時利用western blotting對衰老相關(guān)基因進行檢測，結(jié)果顯示，MMP3在UMSC和DMSC中明顯降低，TNFa在UMSC中明顯降低 (Figure 5G)。以上研究表明，與AMSC和BMSC相比，UMSC和DMSC具有抗衰老的特性。

Figure 5. 單細胞轉(zhuǎn)錄組分析MSCs保守性亞群和組織特異性亞群與衰老相關(guān)的異質(zhì)性

5.?解析來自多個組織的MSCs的不同供體差異

成人組織 (脂肪、骨髓和真皮) 的比例有輕微的供體差異，而來自臍帶的MSCs在不同供體間表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性 (Figure 6A)。UMSC與其他MSCs的相關(guān)性分析表明，每個供體樣本的UMSC與其他組織來源的MSCs相關(guān)性較低 (Figure 6B)。ECM相關(guān)通路主要控制MSCs亞群的異質(zhì)性 (Figure 2D)，通過對UMSC中各供體樣本之間的ECM組分進行分析，發(fā)現(xiàn)ECM組分具有顯著異質(zhì)性，尤其是ECM糖蛋白組分，例如LAMA2, VTN, MFAP4和DPT (Figure 6C–E)。

Figure 6. Donor derived heterogeneity of mesenchymal stem cells (MSCs) across multiple tissues.不同組織MSCs不同供體來源的異質(zhì)性

6.?不同組織間和組織內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)

使用TRRUST對各組織內(nèi)的MSCs亞群進行調(diào)控活性分析，進一步探討轉(zhuǎn)錄組調(diào)控的組織間和組織內(nèi)的相似性和差異性。每個組織中的大多數(shù)組織內(nèi)MSCs亞群都有其特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 (Figure 7B-E)。采用Venn圖進一步比較組織間差異，Venn圖展示了各組織所有結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果說明各組織除了MSCs保守的調(diào)控因子外，還有組織特異性的調(diào)控子 (Figure 7A)。例如，TWIST1、NFIC和DDIT3在DMSCs中特異性富集，而保守性調(diào)節(jié)因子與免疫抑制、增殖和干細胞更新等MSCs本身具有的功能特點相關(guān)。

Figure 7.轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解釋組織間和組織內(nèi)MSC的異質(zhì)性

7.?多組織來源MSCs的異質(zhì)性軌跡分析

作者進一步利用擬時序分析MSCs各組織來源細胞群的變化，并挑選ECM相關(guān)的高變基因來評估這些基因在擬時序軌跡中的表達是否具有組織特異性 (Figure 8)。值得注意的是，這些供體間變化的ECM基因主要在擬時序晚期的UMSCs中表達，并與其他來源的MSCs有所區(qū)別，這表明ECM的改變促進了UMSC的異質(zhì)性，從而降低了UMSC的干性 (Figure 8D)。此外，許多炎癥因子在每個組織中沿著一個軌跡共同表達，CXCL1、CXCL2和CXCL3在四種類型的MSCs中同步發(fā)生 (Figure 8)。

Figure 8.與供體間異質(zhì)性相關(guān)的ECM和促炎基因動力學(xué)熱圖

?結(jié)論?

這篇文章首次在單細胞水平上系統(tǒng)地針對健康供體的MSCs繪制了轉(zhuǎn)錄圖譜，并且系統(tǒng)探討了組織間以及組織內(nèi)的異質(zhì)性，為理解MSCs的免疫抑制的一致性和異質(zhì)性提供了深入的見解。此外，這些發(fā)現(xiàn)為探索MSCs的多種功能和潛在機制提供了基礎(chǔ)，對MSCs的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用具有廣泛的意義。

?參考文獻?

1.?Wang Z, Chai C, Wang R, et al. Single-cell transcriptome atlas of human mesenchymal stem cells exploring cellular heterogeneity. Clin Transl Med. 2021;11(12):e650. doi:10.1002/ctm2.650

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單細胞事業(yè)部建立于2018年，已成為歐易生物的核心部門之一。先后引入多套10x Genomics和 BD RhapsodyTM主流的高通量單細胞分選平臺，以及流式細胞儀等個性化單細胞分選平臺，已獲得10x Genomics公司授權(quán)的單細胞基因表達和空間轉(zhuǎn)錄組雙平臺服務(wù)提供商認證，并與北京、廣州、成都等地協(xié)同科研院所分別成立聯(lián)合實驗室。

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END

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