實驗名稱 濃汁和糞便標(biāo)本中的病原菌檢測

重點思考題回顧

1.培養(yǎng)基的制備

1.1人工培養(yǎng)細(xì)菌需要提供的條件是什么??

v 人工培養(yǎng)細(xì)菌，除需提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)外，尚需有合適的酸堿度、適宜的溫度及必要的氣體環(huán)境。在營養(yǎng)豐富、生長繁殖條件適宜時，細(xì)菌生長繁殖最為迅速。細(xì)菌種類繁多，營養(yǎng)需要千差萬別，但其基本營養(yǎng)要求不外水分、無機(jī)鹽類、含碳化合物和含氮化合物，個別細(xì)菌還需要生長因子等特殊物質(zhì)。

1.2培養(yǎng)基制備的原則是什么??

v 1、選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì)2、營養(yǎng)物質(zhì)濃度及配比合適

1.3怎樣檢查培養(yǎng)基是否合格??

v 滅菌是殺滅培養(yǎng)基中本身的原著菌或在空氣中附著的雜菌,更好的讓目標(biāo)菌生長(減少雜菌消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng),而且有些雜菌會抑制你目標(biāo)菌的生長).一般滅完菌后將培養(yǎng)基放在30-37度的環(huán)境中培養(yǎng)一天,看其有沒有長菌(液體看是否變渾濁,固體看是否長菌落),即知是否滅菌后為無菌

1.4培養(yǎng)基按物理形狀分哪幾種?各有何用途??

v 按物理性質(zhì)分1.液體培養(yǎng)基:不含凝固劑(瓊脂),用于增菌，純培養(yǎng),保種。2.固體培養(yǎng)基:含1％～2％瓊脂，用于分離培養(yǎng),純培養(yǎng),保種。 3.半固體培基（瓊脂高層）:含0.3％～0.5％瓊脂，用于動力檢測,保種。

1.5高壓蒸汽滅菌法的殺菌機(jī)理是什么?

高壓蒸汽滅菌原理是預(yù)真空壓力蒸汽滅菌器是利用機(jī)械抽真空的方法，使滅菌 柜室內(nèi)形成負(fù)壓，蒸汽得以迅速穿透到物品內(nèi)部進(jìn)行滅菌。

細(xì)菌的分離培養(yǎng)

2.1為何取鏈球菌作為空氣的衛(wèi)生指標(biāo)之一??

v 環(huán)境中致病微生物數(shù)量少，需要特異的檢測方法，并且多依靠指示微生物

2.2為什么金黃色葡萄球菌是醫(yī)院內(nèi)感染常見的重要病原菌??

v 金黃色葡萄球菌在自然界廣泛存在,為條件致病菌,是社區(qū)和醫(yī)院感染常見的病原菌之一.隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用,金黃色葡萄球菌易演變成MRＧSA,MRSA 具有致病性強(qiáng)、致死率高的特點,一直是醫(yī)院感染重點監(jiān)測的對象

2.3為什么接種環(huán)使用前后必須燒灼滅菌？忽略了有什么危害??

v 接種前灼燒是為了保證你在接種時不會污染培養(yǎng)物，接種后再灼燒是防止菌種飄出，污染接種室或者超凈臺，影響整體接種環(huán)境，也是降低污染率的一種措施。?

2.4做細(xì)菌培養(yǎng)時，平板為什么要倒置??

1.由于重力的作用使培養(yǎng)基表面及次層能富集微生物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，利于微生物生長

2.防止空氣中微生物的污染培養(yǎng)基及培養(yǎng)物：倒置時平板內(nèi)的空氣是不流動的,雜菌不會沉降到培養(yǎng)基表面,如果不倒置,很快平板周邊會長起雜菌。

3.倒置培養(yǎng)使瓊脂里水分不易蒸發(fā)出去，而充分的保持瓊脂的彈性與細(xì)菌容易繁殖和生存的環(huán)境。如果不倒置，大概3天左右培養(yǎng)基就會出現(xiàn)龜裂等水分散失的情況。. 而一些落菌等試驗，需驗證培養(yǎng)基無菌，就要先倒置培養(yǎng)48小時才可作為模板做落菌，水分散失是很重要的。

2.5培養(yǎng)細(xì)菌的常用方法有哪些??

v 根據(jù)培養(yǎng)細(xì)菌的目的和培養(yǎng)物的特性培養(yǎng)方法分為一般培養(yǎng)法、二氧化碳培養(yǎng)法和厭氧培養(yǎng)法三種。

1、一般培養(yǎng)法：將已接種過的培養(yǎng)基,置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)18－24小時,需氧菌和兼性厭氧菌即可于培養(yǎng)基上生長。少數(shù)生長緩慢的細(xì)菌，需培養(yǎng)3－7天直至一個月才能生長。

為使培養(yǎng)箱內(nèi)保持一定濕度，可在其內(nèi)放置一杯水。培養(yǎng)時間較長的培養(yǎng)基，接種后應(yīng)將試管口塞棉塞后用石臘凡士林封固，以防培養(yǎng)基干裂。

2、二氧化碳培養(yǎng)法：某些細(xì)菌，如牛流產(chǎn)布氏桿菌和胎兒弧菌等需要在含有10％二氧化碳的空氣中才能生長，尤其是初代分離培養(yǎng)要求更為嚴(yán)格。將已接種的培養(yǎng)基置于二氧化碳環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)的方法即二氧化碳培養(yǎng)法，

3、厭氧培養(yǎng)法：常用的厭氧培養(yǎng)方法有厭氧罐法、氣袋法及厭氧箱三種。

2.6從臨床標(biāo)本中分離病原菌，應(yīng)注意哪些事項??

首先挑取一環(huán)(接種環(huán))生理鹽水于玻片上.

再挑一點菌落(量少)

先在玻片上生理鹽水附近磨菌落,把菌落都磨到玻片上,再將生理鹽水拉進(jìn)來,與菌落混合涂勻.如果直接放到生理鹽水里,很可能菌落整塊從環(huán)上脫落就不容易涂開了.

涂好后,在酒精燈火焰上來回拉幾下加熱固定.加熱溫度以不燙手背為宜.如果不固定,染片過程中菌膜容易脫落

干燥,染色

細(xì)菌的純培養(yǎng)

3.1在微生物學(xué)實驗中,怎樣才能避免雜菌的污染??

做實驗前超凈工作臺紫外燈盡量開到30分鐘，操作前注意器具及培養(yǎng)基滅菌，以及手部消毒。操作時，盡量使自己順手，點酒精燈，在酒精燈邊操作（生物安全柜內(nèi)不能使用酒精燈，但有其他高溫裝置）。

接種時，瓶口或試管口需要在酒精燈上旋轉(zhuǎn)過火，塞瓶蓋時，也需要同樣操作。使用金屬接種環(huán)時，需要燒紅，反復(fù)三次。一次性滅菌接種環(huán)則直接用，但注意包裝袋的滅菌。避免瓶子或離心管長時間在超凈工作臺內(nèi)打開，且打開過程中，除操作步驟外，盡量避免任何物品經(jīng)過，包括手部。

移液槍保持潔凈，不與超凈工作臺外槍混用。使用前使用75%酒精擦拭，必要時可塞脫脂棉。（有些移液槍可以直接滅菌）。實驗結(jié)束后進(jìn)行清理，打掃。最后打開紫外燈。處理實驗器具及廢液。

3.2空氣的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定如何??

v 環(huán)境空氣質(zhì)量，是標(biāo)準(zhǔn)為貫徹《 中華人民共和國環(huán)境保護(hù)法 》和《 中華人民共和國大氣污染防治法 》，保護(hù)和改善生活環(huán)境、生態(tài)環(huán)境，保障人體健康制定的標(biāo)準(zhǔn)。 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了環(huán)境空氣功能區(qū)分類、標(biāo)準(zhǔn)分級、污染物項目、平均時間及濃度限值、監(jiān)測方法、數(shù)據(jù)統(tǒng)計的有效性規(guī)定及實施與監(jiān)督等內(nèi)容。

3.3你的實驗結(jié)果說明了什么問題??

v 細(xì)菌的種類繁多。在空氣中特別是人員密集的地方容易產(chǎn)生較多細(xì)菌。

3.4怎樣從醫(yī)務(wù)人員手指上分離和鑒定金黃色葡萄球菌??

v 將醫(yī)務(wù)人員的手指按在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)后取菌五區(qū)劃線。取出金黃色的菌落再純化，得到金黃色葡萄球菌。

3.5菌落特征主要描述哪幾方面問題？如何挑選單菌落？

細(xì)菌菌落的特征描述應(yīng)當(dāng)包括：菌落的大小、形態(tài)、顏色、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起狀態(tài)、邊緣特征等。

把菌液稀釋濃度低些，出現(xiàn)較稀少的單菌落比較好。當(dāng)調(diào)取到純的菌落，進(jìn)行搖平培養(yǎng)，培養(yǎng)時間控制別太長，然后再稀釋涂布分離一次。

細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查

4.1革蘭染色法的關(guān)鍵步驟是什么?為什么??

v 革蘭氏染色四大基本步驟：結(jié)晶紫初染、碘液媒染、乙醇脫色、沙黃復(fù)染，其中乙醇脫色是關(guān)鍵。 因為如果脫色過度，有可能會使革蘭氏陽性菌呈假陰性，如果脫色不夠，有可能使革蘭氏陰性菌呈假陽性。 革蘭氏染色是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，革蘭氏染色屬復(fù)染法，即將標(biāo)本固定后，先用龍膽紫染色，加碘液媒染后用酒精脫色，再用蕃紅復(fù)染。 革蘭染色法，由丹麥病理學(xué)家Christain Gram于1884年創(chuàng)立，是細(xì)菌學(xué)中很重要的鑒別染色法，因為通過此法染色，可將細(xì)菌鑒別為革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-）兩大類。

4.2染色時為什么通常要用新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)物??

v 并不是說絕對需要24小時以內(nèi)新鮮長出來的細(xì)菌，而是要使用處于對數(shù)生長期的細(xì)菌，在這個時期內(nèi)的細(xì)菌，因為菌齡比較年輕，各種細(xì)菌的生理生化反應(yīng)典型而明顯，這樣通過革蘭氏染色才能獲得正確的結(jié)果。 如果使用老齡化的細(xì)菌，那么因為細(xì)菌生理生化現(xiàn)象已經(jīng)不典型，細(xì)胞壁也出現(xiàn)了變化，做革蘭染色可能會出現(xiàn)錯誤。

4.3如何使用油鏡?

1 使用顯微鏡油鏡時，必須將顯微鏡端正直立桌上，不得將鏡臂彎曲，使載物臺傾斜，以免香柏油流溢，影響觀察，污染臺面。?

2 對光?

? 采用天然光為光源時，宜用平面反光鏡；若用人工燈光時，則用凹面鏡。?

? 首先打開光圈，轉(zhuǎn)動反光鏡，使光線集中于集光器?？筛鶕?jù)需要，上下移動集光器和縮放光圈，以獲得最佳光度。?

? 一般用低倍鏡或高倍鏡觀察物象或用油鏡檢查不染色標(biāo)本時，需下降集光器并適當(dāng)?shù)乜s小光圈，使光度減弱；若用油鏡檢查染色標(biāo)本時，光度宜強(qiáng)。應(yīng) 將顯微鏡亮度開關(guān)調(diào)至最亮，光圈完全打開，集光器上升至與載物臺相平。?

3 調(diào)焦距：?

將標(biāo)本片放載物臺上，用標(biāo)本推進(jìn)器固定，將欲檢部分移至接物鏡下。先用低倍鏡找出標(biāo)本的位置，然后提高鏡筒，在標(biāo)本的待檢部位滴鏡油一滴，再換油鏡觀察。?

轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使載物臺徐徐上升（或使鏡筒漸漸下降），直至油鏡頭浸沒至油中。此時眼睛應(yīng)從側(cè)面觀察，以免壓碎標(biāo)本片和損壞鏡頭。?

然后雙眼移至接目鏡，一面從接目鏡觀察，一面反方向緩慢地轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器（下降載物臺，或上升鏡筒），當(dāng)出現(xiàn)模糊物象時，換用細(xì)調(diào)節(jié)器，轉(zhuǎn)動至物象清晰為止。?

? ? 觀察完畢，應(yīng)先提高鏡筒，并將油鏡頭扭向一側(cè)，再取下標(biāo)本片。油鏡頭使用后，應(yīng)立即用擦鏡紙擦凈鏡頭上的油。若鏡油粘稠干結(jié)于鏡頭上，可用擦鏡紙蘸少許二甲苯擦拭鏡頭，并隨即用干的鏡紙擦去殘存的二甲苯，以免二甲苯滲入，溶解用以粘固透鏡的膠質(zhì)物，造成鏡片移位或脫落。

5.細(xì)菌的生化試驗?

5.1細(xì)菌生化反應(yīng)在感染性疾病診斷中有何重要意義??

（1）感染性疾病的病原學(xué)診斷：由細(xì)菌引起的感染性疾病，最確切、最可靠的診斷依據(jù)（“金標(biāo)準(zhǔn)”）是，從患者標(biāo)本中將病原菌分離培養(yǎng)出來，并鑒定其菌屬、種和型。 細(xì)菌的生化反應(yīng)對菌體形態(tài)、革蘭染色反應(yīng)和菌落特征相同和相似的細(xì)菌的鑒定尤為重要。 細(xì)菌藥物敏感試驗?zāi)苤笇?dǎo)臨床選用抗菌藥物治療。

（2）生物制品的制備：制備疫苗、類毒素、抗毒素等用于防治，制備菌液、抗血清等用于診斷。

5.2為什么要在發(fā)酵管液面上方大約2～3cm處切割？?

v 當(dāng)切割面太靠近液面，可能產(chǎn)氣可經(jīng)管口漏出而導(dǎo)致無法判斷是否產(chǎn)氣

5.3培養(yǎng)時，微量糖發(fā)酵管管口不能朝上，為什么？?

v 會使產(chǎn)氣的微量發(fā)酵管的氣體排出， 導(dǎo)致所看到的現(xiàn)象不準(zhǔn)確。

5.4抗菌素敏感性實驗有何實際意義??

v藥物敏感性試驗是針對藥物 對機(jī)體敏感的實驗，在嚴(yán)重感染難于控制或用臨床多種抗生素?zé)o效的病人才做的，當(dāng)然現(xiàn)代提倡做藥敏，以免亂用抗生素。 抗菌藥對細(xì)菌性傳染病的控制起到了非常重要的作用，但由于養(yǎng)殖過程中不科學(xué)的、盲目的濫用抗菌藥，很多致病性細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，使得抗菌藥對細(xì)菌性疾病的控制效果越來越差，不但造成藥物浪費，而且還延誤病情，給養(yǎng)殖戶造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著新型致病菌的不斷出現(xiàn)，抗菌藥的防治效果越來越差。并且各種致病菌對不同的抗菌藥物的敏感性不同，同一細(xì)菌的不同菌株對不同抗菌藥物的敏感性也有差異。長期以來，各種致病菌耐藥性的產(chǎn)生使各種常用抗菌藥物往往失去藥效，以及不能很好的掌握藥物對細(xì)菌的敏感度，所以一個正確的結(jié)果，可供臨床醫(yī)師選用抗菌藥物的參考，并提高療效。

5.5血漿凝固酶試驗觀察完畢，應(yīng)將載玻片立即放入消毒缸內(nèi)，為什么??

防止細(xì)菌暴露在空氣中污染

5.6半固體穿刺接種時，為什么要強(qiáng)調(diào)“原路返回”??

在操作動力實驗的過程中，接種針應(yīng)該要順著原路退出，如果此過程中接種針左右擺動了，會出現(xiàn)本沒有鞭毛的細(xì)菌經(jīng)培養(yǎng)呈現(xiàn)一片渾濁，難以判斷是操作有誤還是細(xì)菌的運動所致。

5.7為保證實驗結(jié)果的可靠性，你認(rèn)為上述試驗應(yīng)還設(shè)立哪些對照??

設(shè)置有一個沒有菌落的半固體穿刺

放置一個只有三個無藥物的圓紙片

設(shè)置只打開不接種的發(fā)酵管

6.細(xì)菌的血清實驗

?案例分析：現(xiàn)在有一個病人，發(fā)熱、不適、全身疼痛5天（前驅(qū)期），懷疑是傷寒沙門菌引起的腸熱癥，請設(shè)計一個實驗，對傷寒沙門菌進(jìn)行分離和鑒定。

? 解析

標(biāo)本的采集與病程的關(guān)系：第1周取外周血，第1-3周取骨髓液，第2周以后取糞便和尿液。?

血液和骨髓液：先增菌培養(yǎng)，然后再用血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、SS瓊脂（黑色菌落）、EMB平板（粉紅色 菌落）分離單菌落。?

糞便：可直接接種于選擇鑒別培養(yǎng)基，如SS瓊脂、EMB平板分離單菌落。?

取血量：一般以肉湯培養(yǎng)基的1/10為宜。常規(guī)方法為用培養(yǎng)基50ml,取血5～10ml,注入培養(yǎng)瓶中。骨髓為1～2ml。細(xì)菌的純培養(yǎng)必須用純的細(xì)菌培養(yǎng)物作鑒定v?

形態(tài)與染色：革蘭陰性桿菌，有周鞭毛。?

動力學(xué)試驗：細(xì)菌自接種部位向四周移動、擴(kuò)散生長，培養(yǎng)基呈云霧狀或根須狀混濁狀態(tài)。?

生化反應(yīng)：分解葡萄糖只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣 ，不發(fā)酵乳糖

血清學(xué)反應(yīng)：主要有O和H兩種抗原。傷寒沙門菌還有Vi抗原。對沙門菌屬的型和亞型鑒定有重要意義。?

玻片凝集試驗：定性鑒定細(xì)菌純培養(yǎng)物。?

肥達(dá)反應(yīng)：用已知傷寒沙門菌菌體（O）抗原、鞭毛（H抗原和甲、乙型副傷寒菌H抗原與患者血清作試管凝集試驗（定量），檢測有無相應(yīng)抗體及其效價，以輔助診斷傷寒或副傷寒。?

正常值：一般是傷寒沙門菌O抗體的凝集效價≥1：80，H抗體凝集效價≥1：160，副傷寒沙門菌H抗體凝集效價≥1：80才有診斷價值。?

動態(tài)觀察：若效價逐次遞增或恢復(fù)期效價比初期≥4倍者更有意義