人源化單克隆抗體CD28

單克隆抗體(Mab)目前已被納入惡性腫瘤、移植排斥、自身免疫和傳染病等以及一系列新適應癥的靶向治療方案。而人源單克隆抗體(Human monoclonal antibody，HuMAb)?更是成為未來抗體發(fā)展的主要研究方向。HuMAb是指完全由人類基因編碼表達的單克隆抗體，它具有更豐富的表位、更低的免疫原性、更長的半衰期、更佳的生物活性等優(yōu)勢，使之在體內(nèi)中發(fā)揮著良好的用途，如體內(nèi)診斷、傳染病預防、抗體療法和疾病預后判斷等。其中，CD28作為一個機制清晰的老靶點，它在免疫治療中發(fā)揮著重要的價值。

CD28分子是由二硫鍵合的44 kDa亞基組成的同源二聚體糖蛋白。每個CD28單體含有134個細胞外氨基酸，具有單個跨膜結(jié)構(gòu)域和短細胞質(zhì)尾。CD28的細胞外結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白可變區(qū)域結(jié)構(gòu)域顯示其同源性。CD28分子的編碼基因由四個外顯子組成，每個外顯子分別定義其蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域。

CD28共刺激作用

T細胞的完全活化依賴于T細胞抗原受體（T-cell receptor, TCR）提供的抗原刺激信號和共刺激受體提供的共刺激信號。CD28是T細胞中關(guān)鍵的共刺激受體，它調(diào)控T細胞的發(fā)育、分化、代謝、遷移等生理過程[1] 。初始T細胞的完全活化通常需要三個信號，第一信號是抗原和抗原受體的結(jié)合，第二信號是共刺激信號，第三信號是細胞因子信號。CD28作為共刺激分子，參與了第二信號的接收。

對于Tc細胞（細胞毒性T細胞）和Th細胞（輔助性T細胞）來說，共刺激信號傳導降低了T細胞活化的閾值，促進了T細胞的增殖和分化。在沒有CD28共刺激存在時，初始T細胞不會被活化，也不會發(fā)生應答。CD28參與的共刺激過程能產(chǎn)生多方面重要的分子效應：

1. 誘導T細胞表面IL-2R（白介素-2受體）的表達，從而? 允許細胞接收第三信號；

2.?使Th細胞開始分泌大量的細胞因子和趨化因子；

3. 誘導表達和上調(diào)表達在Th和Tc細胞內(nèi)其他共刺激和調(diào)節(jié)分子[2]。

當DC（樹突狀細胞）表面的特異pMHC結(jié)合了初始Th或Tc細胞表面多拷貝的某個TCR時將傳遞第一信號。TCR和pMHC結(jié)合，將導致與TCR緊密相鄰的CD3鏈上ITAM被Lck激酶磷酸化。其他胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導相關(guān)酶隨后被募集到此處，與CD4或CD8共受體及CD3鏈的胞質(zhì)尾區(qū)相接觸。這些酶一起介導酶級聯(lián)化學反應，導致其他多個酶的活化。當這種活化級聯(lián)反應出現(xiàn)于多個TCR時，T細胞將接收到第一信號?[2]?。

在多數(shù)情況下，TCR和pMHC的結(jié)合不足以完全活化一個初始Th細胞或Tc細胞，共刺激信號傳導形式的第二信號是必需的。對于Th細胞，接收第一信號后導致Th細胞表面的重要共刺激分子CD28的表達上調(diào)。然而CD28要傳遞第二信號到Th細胞核內(nèi)，其必須同遞呈活化性pMHC的DC表面的配體B7分子相結(jié)合。當免疫突觸最初開始形成時，成熟的DC細胞并沒有表達最佳水平的B7分子，第一信號傳遞到Th細胞及CD28和B7最初結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)果是Th細胞表面跨膜蛋白CD40L的表達上調(diào)，一旦Th細胞表面的CD40L與DC表面的CD40結(jié)合，DC將大大提高其B7的表達及隨后其同Th細胞表面CD28的更強結(jié)合。最終，強有力的第二信號被傳遞到T細胞內(nèi)，從而提高活化性胞內(nèi)信號傳導，而這種出現(xiàn)在T細胞內(nèi)的活化信號轉(zhuǎn)導也是第一信號的結(jié)果。

CD28研究進展

由于CD28表達于T細胞表面，且CD28分子的表達情況在健康人中具有一定的年齡相關(guān)性[3]。人剛出生以后，人體體內(nèi)循環(huán)中幾乎沒有CD28-T細胞，但隨著年齡的增加，CD28-T細胞的數(shù)量便逐漸增多。CD28分子的缺失減少了T細胞抗原受體的多樣性，抑制了抗原誘導的增殖[4]。CD28表達減少通常被認為是T細胞衰老的標志[5]，且CD28缺失是老年人免疫功能不全的關(guān)鍵預測因子。

抗CD28單克隆抗體通過靶向CD28分子胞外結(jié)構(gòu)起作用，根據(jù)其靶抗原表位及其對T細胞的刺激活性可大致分為2類：常規(guī)抗CD28特異性抗體和抗CD28超激動抗體（又名CD28超激動劑，即CD28sa）。在大多數(shù)藥物研發(fā)中，抗CD28抗體藥物主要是指CD28sa。

早期的CD28sa分子起源于1990年后期Thomas Hünig的實驗室，其基于大鼠模型為類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、多發(fā)性硬化癥、格林-巴雷綜合征或1型糖尿病等自身免疫性疾病開發(fā)的免疫療法項目。

然而，CD28的靶向治療手段的應用卻是“命運多舛”。2006年，CD28激動劑（TNG1412）進入臨床實驗，但卻以悲劇收場，并成為當年免疫治療領(lǐng)域的頭條新聞。爾后，TNG1412更名TAB08。研究發(fā)現(xiàn)，當濃度控制在較低水平時，試驗效果良好，目前仍處于臨床試驗階段用于腫瘤治療；2016年，強生公司的CD28單抗藥物（FR04）能夠抑制T細胞的增殖，活化以及阻斷信號通路來達到免疫耐受的效果；2020年10月，首款CD28拮抗劑免疫療法FR104獲得歐洲專利；近年來科研人員對CD28 單克隆抗體的研究依然沒有停止......

?研究1

南方科技大學的田瑞軍、李鵬飛和來自中國科學院大連化學物理研究所的王方軍在《Cell Chem. Biol.》期刊上發(fā)表了一篇以“Motif-DependentImmune Co-receptor Interactome Profiling by Photoaffinity Chemical Proteomics”為題的論文[6] 。

他們利用CD28通過酪氨酸磷酸化(pY)這種翻譯后修飾激活，然后招募下游信號蛋白形成復合物。這些復合物對于T細胞的激活與TCR信號通路至關(guān)重要，因此分析其相互作用組有助于更全面地理解CD28的調(diào)節(jié)功能及其在免疫治療中的應用。

研究2

2017年10月，中科院生物化學與細胞生物學研究所許琛琦研究組與牛津大學Omer Dushek研究組合作在《Nature Structural & Molecular Biology》在線發(fā)表了題為“Dynamic regulation of CD28 conformation and signaling by charged lipids and ions”的論文[7]。

該項研究揭示了CD28的活性調(diào)控機制以及T細胞高抗原敏感性的信號基礎，提出了TCR-Ca2+-CD28所組成的正反饋調(diào)控環(huán)路可以迅速放大T細胞信號強度的機制；揭示了TCR-Ca2+-CD28之間由此形成了正反饋環(huán)路，可以迅速放大抗原刺激信號，從而為T細胞產(chǎn)生高抗原敏感性提供信號基礎。

?總結(jié)? ??

無論是抗腫瘤免疫治療還是器官移植后免疫抑制治療，以及機會性感染的控制，共刺激分子CD28都不失為一個有用的敏感靶點。通過流式技術(shù)監(jiān)測免疫細胞的表型，能夠為臨床研究和治療提供有關(guān)受體免疫狀態(tài)極具價值的信息。我們相信，在未來幾年里，市場上將會有越來越多以CD28為靶點的生物制劑，為廣大深受免疫疾病困擾的患者帶來福音。

同立海源CD28驗證數(shù)據(jù)

高純度HPLC和SDS-PAGE驗證

測試結(jié)果顯示純度達到藥用級標準（≥95%）

高生物活性經(jīng)細胞水平生物活性驗證

流式細胞術(shù)檢測CD28抗體與Jurkat細胞

（人外周血白血病T細胞）

表面CD28的結(jié)合活性，CD28抗體在低濃度

100-300ng/mL下仍然表現(xiàn)出優(yōu)良的結(jié)合能力

參考文獻：

[1]Chen, L. & Flies, D.B. Molecular mechanisms of T cell co-stimulation and co- inhibition.?Nat. Rev. Immunol.?13, 227–242 (2013).

[2]塔克·馬可、瑪麗·桑德斯．免疫應答導論：科學出版社，2012：159-160

[3]FAGNONI F F, VESCOVINI R, MAZZOLA M, et al. Expansion of cytotoxic CD8+ CD28- T cells in healthy ageing people, including centenarians [J]. Immunology, 1996, 88(4): 501-7.

[4] QIN L, JING X, QIU Z, et al. Aging of immune system: Immune signature from peripheral blood lymphocyte subsets in 1068 healthy adults [J]. Aging (Albany NY), 2016, 8(5): 848-59.

[5] VALLEJO A N, NESTEL A R, SCHIRMER M, et al. Aging-related deficiency of CD28 expression in CD4+ T cells is associated with the loss of gene-specific nuclear factor binding activity [J]. J Biol Chem, 1998, 273(14): 8119-29.??

[6]Motif-DependentImmune Co-receptor Interactome Profiling by Photoaffinity Chemical Proteomics,Xiong Chen, Shanping Ji, Zheyi Liu, et al.Cell Chem. Biol.DOI：10.1016/j.chembiol.2022.01.005.

[7]Dynamic regulation of CD28 conformation and signaling by charged lipids and ions,Wei Yang,Weiling Pan,Shuokai Chen,et al.Nature Structural & Molecular Biology,2017-10-23?, DOI:?10.1038/nsmb.3489?.

關(guān)于同立海源

北京同立海源生物科技有限公司，成立十余年專注細胞和基因治療（CGT）上游GMP級原料試劑研發(fā)，致力于為生命科學提供可靠的產(chǎn)品與服務。產(chǎn)品涉及真核重組蛋白、細胞分選試劑、無血清培養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)試劑盒、工具酶。為細胞和基因治療、mRNA開發(fā)、抗體藥物開發(fā)、細胞儲存等生物制藥和IVD領(lǐng)域提供核心原料試劑與服務。

公司建有符合cGMP標準的萬級潔凈車間，包括哺乳動物細胞表達蛋白質(zhì)工程平臺、細胞培養(yǎng)技術(shù)開發(fā)平臺、體外診斷試劑生產(chǎn)平臺，通過ISO13485和ISO9001雙認證，部分產(chǎn)品已獲美國FDA DMF備案。