Science (IF=63.7) |科學(xué)家揭示“有形”生物鐘及其節(jié)律調(diào)控機(jī)制
晝夜節(jié)律，俗稱(chēng)生物鐘，是生物為了適應(yīng)地球自轉(zhuǎn)產(chǎn)生的晝夜更替而形成的一種節(jié)律性生命活動(dòng)規(guī)律，一直被認(rèn)為是生物體內(nèi)一種無(wú)形的“時(shí)鐘”，精密調(diào)控著機(jī)體重要生理功能。這種規(guī)律普遍存在于各種生物中，生物鐘紊亂可引起睡眠障礙、代謝紊亂、免疫力下降，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致各種重大疾病的發(fā)生，如腫瘤、糖尿病、精神異常等。大腦視交叉神經(jīng)上核（SCN）區(qū)域是晝夜節(jié)律的指揮中樞，又稱(chēng)“中樞時(shí)鐘”，協(xié)調(diào)外周器官的生物鐘，調(diào)控多種生理功能，包括免疫力、體溫、血壓、食欲等。然而，SCN維持機(jī)體內(nèi)部節(jié)律穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
2023年6月2日，軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院的李慧艷研究員團(tuán)隊(duì)和張學(xué)敏院士團(tuán)隊(duì)聯(lián)合在Science上在線發(fā)表了題為“Rhythmic Cilia Changes Support SCN Neuron Coherence in Circadian Clock”的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)SCN神經(jīng)元的初級(jí)纖毛是調(diào)控機(jī)體節(jié)律的細(xì)胞器，揭示出“有形”生物鐘的存在及其節(jié)律調(diào)控機(jī)制。此項(xiàng)科學(xué)突破揭示了“有形”生物鐘的存在及其節(jié)律調(diào)控機(jī)制，為節(jié)律紊亂相關(guān)疾病的治療開(kāi)辟了全新路徑。
值得注意的是，在本研究中，作者使用了漢恒生物提供的AAV9-Cre和AAV9-Nms-Cre病毒，成功獲得了Shh和Ptch1組織特異性敲除小鼠。
在此項(xiàng)研究中，作者首先觀測(cè)到小鼠大腦組織中大部分SCN神經(jīng)元含有初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)初級(jí)纖毛的數(shù)量和長(zhǎng)度表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律性，而這種節(jié)律與細(xì)胞周期無(wú)關(guān)，與具有生物鐘和遷移功能的Cry1(Cryptochrome 1)蛋白的節(jié)律完全相反。此外，在生物鐘表達(dá)基因Bmal1(MOP3或ARNTL)缺陷的小鼠中，初級(jí)纖毛的表達(dá)豐度的晝夜節(jié)律性消失。之后，作者在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也驗(yàn)證了初級(jí)纖毛的長(zhǎng)度具有晝夜節(jié)律性變化；綜上表明初級(jí)纖毛的豐度和長(zhǎng)度具有晝夜節(jié)律性。
圖1 SCN中初級(jí)纖毛的豐度和長(zhǎng)度具有晝夜節(jié)律性
接著，作者通過(guò)免疫熒光雙染對(duì)不同的神經(jīng)元和初級(jí)纖毛進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)初級(jí)纖毛主要存在于SCN神經(jīng)元中的神經(jīng)肽神經(jīng)素S(NMS)神經(jīng)元中。為了進(jìn)一步探究初級(jí)纖毛在晝夜節(jié)律中的調(diào)控作用，作者通過(guò)將Nms-Cre鼠和Ift88fl/fl或Ift20fl/fl鼠進(jìn)行雜交，從而獲得纖毛形成所需的兩個(gè)基因Ift88和Ift20敲除的小鼠，進(jìn)而阻斷NMS神經(jīng)元中初級(jí)纖毛的形成。研究結(jié)果表明，Ift88或Ift20的缺失不會(huì)影響小鼠的發(fā)育和SCN神經(jīng)元的形態(tài)。進(jìn)一步在時(shí)差實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠需要7-9天才能適應(yīng)新的時(shí)間周期，而SCN纖毛特異缺陷小鼠僅需1-2天就適應(yīng)了新的時(shí)間周期。由此表明NMS神經(jīng)元纖毛在晝夜節(jié)律中具有特殊的功能。接著，進(jìn)一步研究表明SCN纖毛特異缺陷小鼠對(duì)周期的適應(yīng)性并不受環(huán)境的影響，而是內(nèi)部時(shí)鐘的快速相移引起的。
? ? 圖2 NMS神經(jīng)元中的初級(jí)纖毛維持晝夜節(jié)律
為了進(jìn)一步探究初級(jí)纖毛是否參與SCN神經(jīng)元之間的細(xì)胞間偶聯(lián)，作者利用Luciferase作為報(bào)告基因標(biāo)記小鼠體內(nèi)生物鐘基因Per2，用于記錄晝夜節(jié)律。研究結(jié)果顯示，正常處理后對(duì)照組(Nms-Cre、Ift88fl/fl)和實(shí)驗(yàn)組Nms-Ift88-/-小鼠SCN的晝夜節(jié)律表現(xiàn)一致；利用TTX阻斷SCN 神經(jīng)元的細(xì)胞間偶聯(lián)，發(fā)現(xiàn)TTX破壞了對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠SCN神經(jīng)元的節(jié)律性，去除TTX后，對(duì)照組小鼠SCN神經(jīng)元恢復(fù)節(jié)律，而Nms-Ift88-/-小鼠SCN神經(jīng)元節(jié)律未恢復(fù)。由此表明，NMS中初級(jí)纖毛促進(jìn)了SCN神經(jīng)元細(xì)胞間的偶聯(lián)。此外，為了驗(yàn)證受細(xì)胞間偶聯(lián)影響的溫度抵抗是否與初級(jí)纖毛有關(guān)，作者用不同的溫度循環(huán)處理對(duì)照組(Nms-Cre、Ift88fl/fl)和Nms-Ift88-/-小鼠，研究結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠節(jié)律并未發(fā)生變化，而Nms-Ift88-/-小鼠節(jié)律發(fā)生明顯的移位。結(jié)果表明，無(wú)纖毛的SCN對(duì)周期性溫度變化的抗性較弱；由此推測(cè)，這種抗性可能源于SCN中纖毛依賴(lài)性的細(xì)胞間偶聯(lián)。
圖3? 初級(jí)纖毛促進(jìn) SCN 中的神經(jīng)元間耦合
Shh基因在SCN神經(jīng)元中廣泛表達(dá)，并且Shh信號(hào)通路（Sonic Hedgehog）靶基因Gli1(GLI family zinc finger 1)和 Ptch1(patched 1)在LD（光照黑暗交替，12h）和DD（全黑暗）條件下表現(xiàn)出節(jié)律性振蕩，而這種節(jié)律振蕩在Nms-Ift88-/-小鼠或Bmal1缺陷小鼠中消失，由此推測(cè)Shh信號(hào)通路有可能在節(jié)律調(diào)節(jié)中起重要作用。緊接著，作者探究了初級(jí)纖毛介導(dǎo)SCN神經(jīng)元細(xì)胞間偶聯(lián)的機(jī)制。首先，作者借助Smo(Smoothened)敲除的小鼠Nms-Smo-/-小鼠(smoothened，Smo的富集是啟動(dòng)Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)所必需的)阻斷SCN神經(jīng)元中的Shh信號(hào)，在時(shí)差實(shí)驗(yàn)中，Nms-Smo-/-小鼠可以立即進(jìn)入LD周期；此外，作者發(fā)現(xiàn)SMO激動(dòng)劑能促進(jìn)Per2的表達(dá)，以及延遲SCN 晝夜節(jié)律振蕩。接著，為了進(jìn)一步驗(yàn)證Shh信號(hào)通路在節(jié)律調(diào)節(jié)中的作用，作者借助漢恒生物提供的AAV9-Cre病毒工具獲得SCN區(qū)Shh特異性敲除的小鼠，在時(shí)差實(shí)驗(yàn)中Shh-/-小鼠也能立即重新進(jìn)入LD周期，與之前結(jié)果一致；為了進(jìn)一步探究Shh信號(hào)通路在SCN中的功能，作者借助漢恒生物提供的AAV9-Nms-Cre病毒工具，在小鼠SCN的NMS神經(jīng)元中特異性敲除 Shh信號(hào)的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子Ptch1，時(shí)差實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前面一致，Ptch1-/-小鼠也能立即重新進(jìn)入LD周期，由此表明Shh信號(hào)通路在NMS神經(jīng)元纖毛中表現(xiàn)的晝夜節(jié)律中發(fā)揮重要作用。此外，作者利用單細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光素酶發(fā)光成像技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Shh信號(hào)通路可能促進(jìn)SCN神經(jīng)元之間的細(xì)胞間偶聯(lián)。
圖4? Shh信號(hào)通路維持SCN中的晝夜節(jié)律
最后，作者檢測(cè)了多個(gè)核心生物鐘基因(Per1, Cry1, Bmal1和Clock)和已知介導(dǎo)細(xì)胞間偶聯(lián)的神經(jīng)肽(Vip、Grp、Avp、Prok2)的節(jié)律性表達(dá)，在Nms-Ift88-/-和 Nms-Smo-/-小鼠中，核心生物鐘基因和細(xì)胞間偶聯(lián)的神經(jīng)肽基因的節(jié)律性發(fā)生了改變，并且，在Nms-Ift88-/-和 Nms-Smo-/-小鼠中的Vip和Grp的蛋白表達(dá)顯著下降。由此表明，SCN神經(jīng)元的纖毛缺失導(dǎo)致核心生物鐘基因核神經(jīng)肽的振蕩減弱。
圖5 纖毛依賴(lài)性Shh信號(hào)調(diào)節(jié)時(shí)鐘基因和神經(jīng)肽的節(jié)律
綜上所述， NMS神經(jīng)元上的初級(jí)纖毛依賴(lài)性Shh信號(hào)通過(guò)細(xì)胞間耦合在晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，這提示靶向Shh通路的藥物可能具有用于治療生物節(jié)律破壞相關(guān)疾病的潛能。隨著時(shí)代的發(fā)展與科技的進(jìn)步，社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)和工作壓力與日俱增，全球大約1/3的人存在節(jié)律紊亂問(wèn)題，表現(xiàn)為睡眠障礙等癥狀。由于缺乏對(duì)生物節(jié)律調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識(shí)，當(dāng)前國(guó)際上尚未能研究出基于生物節(jié)律的有效治療藥物。此次有關(guān)生物鐘的重要發(fā)現(xiàn)，也是我國(guó)腦科學(xué)研究的一次重大突破。
