本期特邀孫紹光教授團隊分享解讀，感謝河北醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室孫紹光教授團隊對circRNA平臺的關(guān)注！

心血管疾病是人類健康的巨大威脅，導致了全球超過三分之一患者的死亡。血管重構(gòu)所致的血管壁增厚和管腔狹窄是動脈粥樣硬化、術(shù)后血管再狹窄等心血管疾病的重要病理學特征。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）是構(gòu)成血管壁中膜的主要細胞成分，其發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，獲得異常增殖、遷移能力，發(fā)生自噬異常，是血管重構(gòu)性疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因。鑒定血管重構(gòu)相關(guān)的新型調(diào)節(jié)分子，揭示其調(diào)控功能和機制，有助于深入理解血管重構(gòu)性疾病的發(fā)病機制，并為發(fā)掘新型治療靶點提供依據(jù)。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類在前體RNA剪接過程中產(chǎn)生的、具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA。circRNA沒有末端，能夠抵抗核酸外切酶介導的降解，比線性RNA具有更好的穩(wěn)定性。circRNA一般可通過結(jié)合microRNA、蛋白質(zhì)，或作為模板編碼蛋白質(zhì)/多肽發(fā)揮調(diào)控作用。有研究表明，circRNA 在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但其調(diào)控機制目前遠沒被闡明。鑒定具有同時調(diào)節(jié)VSMC增殖、遷移和自噬的circRNA，對于血管重構(gòu)性疾病治療靶點的開發(fā)具有重要意義。

2023年7月25日，《Journal of Advanced Research》（IF=10.7）發(fā)表了河北醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室孫紹光教授團隊的研究論文，題為“Hsa_circ_0001402 alleviates vascular neointimal hyperplasia through a miR-183-5p-dependent regulation of vascular smooth muscle cell proliferation, migration, and autophagy”。該研究率先鑒定了一種可同時調(diào)控血管平滑肌細胞（VSMC）增殖、遷移和自噬的circRNA。具體而言，hsa_circ_0001402通過海綿吸附miR-183-5p，靶向FKBPL抑制VSMC增殖和遷移，靶向BECN1激活VSMC自噬，從而抑制血管內(nèi)膜增生。hsa_circ_0001402/miR-183-5p有望成為血管重構(gòu)性疾病的干預靶點。

亮 點

1. 過表達hsa_circ_0001402可抑制VSMC增殖、遷移，激活自噬，抑制血管內(nèi)膜增生。

2. hsa_circ_0001402是miR-183-5p分子海綿。

3. miR-183-5p通過結(jié)合FKBPL CDS區(qū)抑制FKBPL的蛋白表達水平，促進VSMC增殖和遷移，從而促進血管內(nèi)膜增生。

4. miR-183-5p通過結(jié)合BECN1 3′-UTR抑制BECN1的蛋白表達水平，抑制VSMC自噬，從而促進血管內(nèi)膜增生。

1.hsa_circ_0001402的鑒定分析

孫紹光教授團隊在前期工作中，通過基因芯片在PDGF-BB誘導的VSMC中篩選出134種差異表達circRNA（GSE77278）。其中hsa_circ_0001402在人和小鼠中高度保守，在增殖型VSMC中表達降低（圖1A-D）。在誘導自噬的VSMC中，hsa_circ_0001402表達升高（圖1D-F）。hsa_circ_0001402由TBC1D1基因的13-15號外顯子環(huán)化形成（圖1G）。聯(lián)合RNase R和放線菌素D處理實驗，證實hsa_circ_0001402的環(huán)狀性質(zhì)（圖1H-I）。聯(lián)合核/質(zhì)RNA檢測和RNA FISH檢測，證實hsa_circ_0001402主要分布在細胞質(zhì)中（圖1J-K）。

2.過表達hsa_circ_0001402可抑制VSMC增殖和遷移，激活VSMC自噬

接著，作者對hsa_circ_0001402的調(diào)控功能進行了論證。首先，聯(lián)合Western blot、EdU和CCK-8分析，證實過表達hsa_circ_0001402能夠抑制VSMC增殖（圖2A-D）。然后，聯(lián)合Western blot和細胞劃痕分析，證明過表達hsa_circ_0001402能夠抑制VSMC遷移（圖2E-H）。最后，聯(lián)合Western blot、細胞自噬流檢測和透射電鏡自噬溶酶體檢測，證實過表達hsa_circ_0001402能夠激活VSMC自噬（圖2I-N）。

3.miR-183-5p通過下調(diào)FKBPL促進VSMC增殖和遷移

作者進一步探索了hsa_circ_0001402的調(diào)控機制。通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001402能夠海綿吸附miR-183-5p，而miR-183-5p能夠結(jié)合細胞增殖/遷移相關(guān)FKBPL的編碼區(qū)（CDS）。qRT-PCR分析表明，miR-183-5p在增殖的VSMC中表達升高（圖3B-C）。聯(lián)合Western blot、EdU和CCK-8、細胞劃痕和雙熒光素酶報告基因分析，證明過表達miR-183-5p通過靶向FKBPL CDS抑制FKBPL蛋白表達水平，從而促進VSMC增殖和遷移（圖3D-N）。相反，敲減miR-183-5p能夠上調(diào)FKBPL，從而抑制VSMC增殖和遷移（圖3O-W）。綜上，miR-183-5p通過抑制FKBPL蛋白表達，促進VSMC增殖和遷移。

4.miR-183-5p通過下調(diào)BECN1抑制VSMC自噬

另外，通過生物信息學分析還發(fā)現(xiàn)，miR-183-5p能夠結(jié)合自噬相關(guān)BECN1的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）。qRT-PCR分析表明，miR-183-5p在誘導自噬的VSMC中表達降低（圖3C，4A）。聯(lián)合Western blot、細胞自噬流檢測和透射電鏡自噬溶酶體檢測，證實過表達miR-183-5p通過靶向BECN1 3′-UTR抑制BECN1蛋白表達水平，從而抑制VSMC自噬（圖4B-I）。相反，敲減miR-183-5p能夠上調(diào)BECN1，從而激活VSMC自噬（圖4J-M）。綜上，miR-183-5p通過下調(diào)BECN1蛋白表達水平，抑制VSMC自噬。

5.miR-183-5p通過下調(diào)FKBPL和BECN1促進血管內(nèi)膜增生

作者采用小鼠頸總動脈結(jié)扎模型，論證了miR-183-5p對血管內(nèi)膜增生的作用。qTR-PCR分析表明，miR-183-5p在內(nèi)膜增生血管中表達升高（圖5A）。聯(lián)合H&E和免疫熒光分析，證實過表達miR-183-5p通過下調(diào)FKBPL和BECN1促進血管內(nèi)膜增生（圖5）。相反，敲減miR-183-5p通過上調(diào)FKBPL和BECN1抑制血管內(nèi)膜增生（圖6）。

6.過表達hsa_circ_0001402通過海綿吸附miR-183-5p上調(diào)FKBPL和BECN1表達

接下來，作者論證了hsa_circ_0001402是否通過miR-183-5p/FKBPL軸和miR-183-5p/BECN1軸發(fā)揮作用。聯(lián)合qRT-PCR和雙熒光素酶報告基因分析，過表達hsa_circ_0001402能夠通過海綿吸附miR-183-5p來降低其表達（圖7A-C）。聯(lián)合Western blot、EdU、CCK-8、細胞劃痕的挽救實驗，證實過表達miR-183-5p能夠挽救過表達hsa_circ_0001402對VSMC增殖和遷移的抑制，從而促進VSMC增殖和遷移（圖7D-J）。聯(lián)合Western blot和雙熒光素酶報告基因分析，證實過表達hsa_circ_0001402能夠海綿吸附miR-183-5p，減少miR-183-5p對FKBPL的靶向抑制，從而升高FKBPL蛋白水平（圖7K-M）。聯(lián)合EdU、CCK-8、細胞劃痕的挽救實驗，證實敲減Fkbpl能夠挽救過表達hsa_circ_0001402對VSMC增殖和遷移的抑制，從而促進VSMC增殖和遷移（圖7N-R）。此外，聯(lián)合Western blot和透射電鏡自噬溶酶體檢測的挽救實驗，證實過表達miR-183-5p能夠挽救過表達hsa_circ_0001402對VSMC自噬的激活，從而抑制VSMC自噬（圖7S-V）。聯(lián)合Western blot和雙熒光素酶報告基因分析，證明過表達hsa_circ_0001402能夠海綿吸附miR-183-5p，減少miR-183-5p對BECN1的靶向抑制，從而升高BECN1蛋白水平（圖7W-X）。綜上所述，hsa_circ_0001402通過hsa_circ_0001402/miR-183-5p/FKBPL軸和hsa_circ_0001402/miR-183-5p/BECN1軸在VSMC中發(fā)揮作用。

7.過表達hsa_circ_0001402通過上調(diào)FKBPL和BECN1抑制血管內(nèi)膜增生

同樣采用小鼠頸總動脈結(jié)扎模型，論證了hsa_circ_0001402對血管內(nèi)膜增生的作用。聯(lián)合H&E染色和免疫熒光分析，證明過表達hsa_circ_0001402通過上調(diào)FKBPL和BECN1抑制血管內(nèi)膜增生（圖8）。

結(jié)論

總之，hsa_circ_0001402通過海綿吸附miR-183-5p，同時靶向調(diào)控FKBPL和BECN1，二者分別調(diào)節(jié)VSMC增殖/遷移和自噬，最終協(xié)同抑制血管內(nèi)膜增生。本研究為發(fā)掘血管重構(gòu)相關(guān)疾病的治療靶點提供了新思路。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.jare.2023.07.010