寫在前面

????????今天推薦的是由意大利國家癌癥研究所在2019年5月8日發(fā)表于Science Advances（IF：12.477，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Gustavo Baldassarre教授，研究表明USP1通過調(diào)節(jié)Snail穩(wěn)定性關(guān)聯(lián)鉑金抗性與癌細胞傳播。

研究背景

????????對鉑類化療的耐藥性在癌癥患者中非常常見，一般與腫瘤擴散和轉(zhuǎn)移有關(guān)。鉑金治療本身是否會激活與腫瘤擴散有關(guān)的分子途徑尚不清楚。

摘要部分

????????在這里，作者研究發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶1（USP1）通過調(diào)節(jié)Snail的穩(wěn)定性來介導(dǎo)卵巢癌細胞對鉑金的抗性，而Snail又能促進腫瘤擴散。在分子水平上，觀察到在鉑金處理后，USP1被ATM和ATR磷酸化并與Snail結(jié)合。然后，USP1去泛素化并穩(wěn)定Snail的表達，賦予其對鉑金的抗性，增加干細胞樣特征和轉(zhuǎn)移能力。另一方面，USP1的基因敲除或藥物抑制增加了鉑金的敏感性，并以Snail依賴的方式減少了轉(zhuǎn)移性傳播。作者的研究結(jié)果確定了Snail是USP1的一個靶點，并為克服鉑金抗性和更成功地治療卵巢癌患者的新策略開辟了道路。

研究內(nèi)容

1.USP1是OC細胞中鉑金反應(yīng)和干細胞樣特征的關(guān)鍵媒介?

????????為了確定OC細胞中鉑金反應(yīng)的新媒介，作者使用了基于短發(fā)夾RNA（shRNA）的功能缺失篩選確定了50個候選基因。然后在四個不同的OC細胞系中進行了驗證性篩選，每個基因使用五個特定的shRNA。進一步的驗證實驗表明，USP1沉默使MDAH-2774細胞中的CBDCA半數(shù)最大抑制濃度（IC50）降低了約三倍。在CDDP（鉑類化合物，包括順鉑）處理后，作者證實USP1沉默明顯降低了所有測試細胞系的CDDP IC50。?

????????除了在DDR途徑中的作用外，最近的報告表明USP1在EMT和干細胞狀態(tài)調(diào)節(jié)中的作用。作者觀察到USP1的基因和藥物失活降低了基礎(chǔ)和CDDP誘導(dǎo)的與癌癥干細胞表型相關(guān)的基因表達，包括KLF4、Sox2和c-Myc。此外，通常用于評估癌癥干細胞特征的球狀體形成試驗顯示，在未處理和CDDP處理的條件下，USP1沉默的細胞形成的球狀體比對照細胞少，支持USP1在獲得干細胞樣表型中的作用。

????????此外，作者在三維（3D）Matrigel規(guī)避試驗和體外間皮細胞清除試驗中測試了對照組和USP1沉默的細胞，以模擬OC轉(zhuǎn)移過程的最初步驟，并評估USP1在這方面的作用。USP1沉默的細胞顯示出逃避三維基質(zhì)的能力下降，也顯示出附著、消化和侵入間皮細胞單層的能力。?

研究結(jié)論：通過篩選發(fā)現(xiàn)USP1沉默明顯降低了所有測試細胞系的CDDP IC50，USP1在調(diào)節(jié)CDDP敏感性和控制OC細胞的干細胞樣和入侵特征方面具有關(guān)鍵作用。

?

2.USP1是CDDP處理的細胞中Snail蛋白上調(diào)的必要條件

????????EMT轉(zhuǎn)錄因子Zeb1、Snail和Twist-1促進了OC細胞對間皮的定植。一些研究表明，這些轉(zhuǎn)錄因子也被鉑金治療激活，并能控制化療抗性。因此，作者觀察到在CDDP處理的OC細胞中，Snail、Slug和Twist-1的表達大幅上調(diào)，但在所有測試模型中，只有Snail被CDDP持續(xù)上。USP1沉默減少了基礎(chǔ)和CDDP誘導(dǎo)的Snail表達，而對Twist-1、Slug和Zeb1沒有影響。使用USP1抑制劑SJB3-019A和匹莫齊特，無論是單獨使用還是在CDDP處理后，都能觀察到類似的效果，這證實了Snail表達的減少是USP1活性降低的直接結(jié)果。另一方面，通過時間過程分析表明，USP1和Snail的表達與DDR的激活同步。

研究結(jié)論：USP1是CDDP處理的細胞中Snail蛋白上調(diào)的必要條件，且USP1和Snail的表達與DDR的激活同步。

?

3.USP1去泛素化并穩(wěn)定Snail蛋白

????????在USP1沉默后，Snail的mRNA水平?jīng)]有變化，這表明蛋白質(zhì)的下調(diào)是在轉(zhuǎn)錄后水平上控制的。此外，當(dāng)用蛋白酶體抑制劑MG132處理時，USP1沉默的細胞顯示出Snail的積累，這表明Snail可能受到蛋白酶體降解的調(diào)節(jié)。因此，作者假設(shè)USP1可能通過控制Snail的泛素化水平來調(diào)節(jié)Snail的表達，并觀察到USP1很容易與Snail共沉淀，無論是在外源性還是內(nèi)源性水平，它們的相互作用在CDDP處理中得到加強。USP1野生型（USP1WT），相比突變體USP1C90S，在轉(zhuǎn)染了His-泛素的293T/17細胞中明顯減少了泛素化的Snail的數(shù)量。

研究結(jié)論：Snail是一個新的USP1靶點。

?

4.Snail介導(dǎo)USP1對CDDP引起的細胞死亡的保護作用?

????????除了眾所周知的EMT誘導(dǎo)劑的作用外，Snail還被證明在一些癌癥模型中介導(dǎo)鉑金抗性。研究發(fā)現(xiàn)，Snail沉默增加了對CDDP的敏感性，并導(dǎo)致CHK1磷酸化的減少和H2AX表達的增加。與單獨沉默USP1或Snail相比，聯(lián)合剝奪USP1和Snail并沒有導(dǎo)致細胞死亡增強。另一方面，在USP1沉默的細胞中過度表達Snail使CDDP在USP1沉默的細胞中的IC50增加了約五倍。

研究結(jié)論：USP1和Snail位于同一軸線上，而且Snail極大介導(dǎo)了USP1對OC細胞中CDDP敏感性。

?

5.USP1基因敲除的OC細胞對CDDP高度敏感，并且不能在CDDP的作用下上調(diào)Snail

????????作者觀察到，USP1 KO細胞表達的Snail基礎(chǔ)水平較低，并且在CDDP處理后未能上調(diào)Snail、KLF4和c-Myc。與USP1 WT相比，USP1KO細胞對CDDP處理更敏感，無論是在藥物反應(yīng)曲線還是在菌落試驗中。此外，在基礎(chǔ)條件下和用CDDP處理時，它們形成的球狀體（卵巢球）較少，而且在三維Matrigel中的侵入性較低。這些USP1KO細胞的表型都能通過過量表達Snail而得到回補，這證實了Snail在CDDP處理后介導(dǎo)了USP1的作用。

研究結(jié)論：USP1基因敲除的OC細胞對CDDP高度敏感，并且不能在CDDP的作用下上調(diào)Snail。

?

6.ATM/ATR使USP1磷酸化，有利于USP1/Snail在CDDP處理下的相互作用?

????????Snail 蛋白被激酶高度磷酸化，促進其降解或穩(wěn)定，從而調(diào)節(jié)其半衰期。為了評估Snail的磷酸化是否介導(dǎo)了它與USP1的相互作用，作者從Snail/USP1轉(zhuǎn)染的細胞中提取了蛋白質(zhì)，磷酸酶處理僅略微降低了基礎(chǔ)Snail/USP1的相互作用，但在CDDP處理后幾乎完全阻止了它們的結(jié)合，這表明Snail、USP1或兩者的磷酸化是必要的。?

????????作者用一個抗PS/TQ抗體來評估可磷酸化的絲氨酸在CDDP處理后是否變得磷酸化。沒有檢測到Snail上的S/TQ磷酸化，而USP1在CDDP處理后S/TQ上有相當(dāng)大的磷酸化。為了評估USP1的磷酸化是否由ATM/ATR直接作用，作者用CDDP結(jié)合ATM（Ku55933）和/或ATR（VE-821）的選擇性抑制劑處理OC細胞并進行聯(lián)合IP實驗。ATM和ATR的聯(lián)合抑制強烈地減少了OC細胞中內(nèi)源性USP1的S/TQ磷酸化，并阻止了Snail/USP1的結(jié)合。此外，USP1的磷酸化對USP1介導(dǎo)的Snail的穩(wěn)定很重要，因為抑制ATM/ATR會減少CDDP誘導(dǎo)的Snail蛋白上調(diào)。

研究結(jié)論：ATM和ATR對USP1的S/TQ磷酸化是USP1介導(dǎo)的Snail穩(wěn)定性的一個關(guān)鍵步驟。

?

7.USP1在S42和S331上的磷酸化是其與Snail結(jié)合的必要條件

????????作者接下來利用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法觀察到，在基礎(chǔ)條件下，USP1有四個絲氨酸被磷酸化，但只有S42的磷酸化在CDDP處理后強烈增加。為了證實這些數(shù)據(jù)，作者產(chǎn)生了抗PS42和抗PS331磷酸化特異性抗體，并在轉(zhuǎn)染了USP1WT或雙磷酸化突變體USP1S42A/S331A的OVCAR-8 KO細胞中測試其特異性。研究發(fā)現(xiàn)，S42和S331的磷酸化在CDDP處理的細胞中都有所增加，在MDAH-2774和OVCAR-8細胞的內(nèi)源性USP1上也觀察到同樣的結(jié)果。

????????上述實驗表明，ATM和ATR抑制劑強烈地減少了CDDP誘導(dǎo)的USP1S42磷酸化。因此作者認為S42 和/或 S331 磷酸化可能參與 USP1 與Snail 的相互作用。為了證實該設(shè)想，作者將USP1S42A、USP1S331A或USP1S42A/S331A突變體與Snail轉(zhuǎn)染，并進行聯(lián)合IP試驗。作者觀察到，當(dāng)兩個殘基中的任何一個發(fā)生突變時，USP1與Snail的結(jié)合就會大大減弱。

研究結(jié)論：S42和/或S331的磷酸化參與USP1與Snail的相互作用。

?

8.USP1對OC細胞的轉(zhuǎn)移性傳播是必要的

????????OC患者的預(yù)后不佳，主要是由于出現(xiàn)了化療耐藥性疾病，并向腹膜和網(wǎng)膜以及位于腹腔的器官擴散。為了驗證USP1是否通過穩(wěn)定Snail在OC細胞的轉(zhuǎn)移性傳播中發(fā)揮了作用，作者利用OVCAR-8異種移植的腹腔內(nèi)傳播模型。為此，作者構(gòu)建了OVCAR-8 USP1 KO細胞，穩(wěn)定地重新表達USP1WT或USP1S42A/S331A。重新表達USP1WT可以調(diào)節(jié)Snail的表達，且無論是在基礎(chǔ)條件下還是在CDDP處理后，都可以回補OVCAR-8親代細胞的卵巢球形成能力。此外，在該細胞中沉默Snail，足以使卵球形成能力下降到與USP1 KO細胞相同的水平，證實Snail是該信號軸中USP1的關(guān)鍵下游目標。?

????????為了驗證這些體外表型是否轉(zhuǎn)化為OC細胞在體內(nèi)生長的不同能力，作者將構(gòu)建的細胞及其參照細胞通過腹腔注射到雌性裸鼠體內(nèi)，并通過宏觀觀察壞死和病理分析來評估腫瘤的擴散。注射USP1WT細胞的小鼠的腫瘤負擔(dān)明顯高于注射USP1 KO細胞或重新表達USP1S42A/S331A的細胞。綜合宏觀和病理分析表明，USP1 KOOVCAR-8細胞幾乎完全不能生長，與體外觀察到的卵球和三維Matrigel侵襲試驗相類似。重新表達USP1WT的USP1 KO細胞有效地傳播到小鼠腹部。這些表型與Snail的表達一致，與表達USP1S42A/S331A的細胞的腫瘤相比，Snail在腫瘤中的表達被下調(diào)，總體上證實了在體外觀察到的情況。

????????為了驗證Snail是否是體內(nèi)USP1活性的關(guān)鍵媒介，作者在雌性裸鼠體內(nèi)腹腔注射OVCAR-8 USP1 WT、USP1 KO和穩(wěn)定過表達Snail的USP1 KO細胞（USP1KO + Snail）。Snail的過表達恢復(fù)了OVCAR-8USP1 KO細胞的生長和擴散到腹腔的能力。

研究結(jié)論：USP1通過調(diào)節(jié)Snail的基礎(chǔ)表達和鉑金誘導(dǎo)表達，可以作為一個有效的治療靶標，以防止OC擴散。

?

9.USP1的高表達和活性預(yù)示著符合鉑金治療條件的患者預(yù)后不佳?

????????為了驗證USP1/Snail軸在人類病理學(xué)中的作用，作者首先分析了網(wǎng)上提供的KM Plotter數(shù)據(jù)集）。USP1的高mRNA水平預(yù)示著OC患者的無進展生存期（PFS）和總生存期（OS）較低。與作者觀察到的USP1調(diào)節(jié)Snail蛋白的穩(wěn)定性而不是其mRNA的表達一致，Snail mRNA的表達與患者的生存率沒有關(guān)系。?

????????接下來，作者在本院收集的OC患者（n = 10）的匹配原發(fā)和同步轉(zhuǎn)移病灶中進行了USP1的免疫組織化學(xué)（IHC）分析。USP1在所有標本中都高度表達。由于無法通過IHC獲得特異性染色，作者建立了一個 "對USP1抑制的反應(yīng)性 "的試驗，用CDDP±pimozide處理一組OC細胞系，然后通過Western blot分析Snail蛋白的表達。在10個測試的細胞系中的8個，作者稱之為"反應(yīng)者"，匹莫齊特阻礙了CDDP處理后Snail的上調(diào)表達。對CDDP±匹莫齊特處理沒有反應(yīng)的兩個細胞系（"無反應(yīng)者"）也對鉑金后USP1沉默誘導(dǎo)的細胞死亡不敏感。?

????????作者接下來在五個原生OC細胞系中使用了同樣的檢測方法。所有的原代細胞都表達了USP1，但只有三個細胞根據(jù)上述指定的標準被歸類為反應(yīng)者。因此，當(dāng)作者用增加劑量的CDDP與匹莫齊特聯(lián)合治療原發(fā)性O(shè)C細胞系時，作者發(fā)現(xiàn)藥物抑制USP1只在反應(yīng)者細胞中表現(xiàn)出劑量依賴性的細胞毒性，證實USP1/Snail也影響了OC原發(fā)性細胞的CDDP反應(yīng)。作者接下來探討了與USP1活性相關(guān)的mRNA特征是否能預(yù)測OC患者的預(yù)后，并選擇了該特征中10個上調(diào)幅度最大的基因。作者分析了KM Plotter數(shù)據(jù)集，并觀察到這10個基因特征，比單獨使用USP1表達的效果更好，能夠分離出PFS和OS較差的OC患者。

????????鑒于上述結(jié)果，作者想知道這一特征是否可以作為鉑金敏感性的一個更普遍的生物標志物，作者選擇了乳腺癌作為模型。USP1和上述10個基因都能預(yù)測MDA-MB 468（TNBC）的PFS (progression-free survival)，但不能預(yù)測雌激素受體陽性（ER+）的BC，這證實了該標志物在檢測符合鉑金治療的患者中具有較高的抗藥性和疾病進展風(fēng)險的穩(wěn)健性。此外，在體外培養(yǎng)中，MDA-MB 468（TNBC），而不是MCF-7（ER+）細胞系，在CDDP處理時上調(diào)Snail，USP1的抑制損害了CDDP誘導(dǎo)的Snail的過表達，證明USP1/Snail軸在不同鉑金敏感腫瘤的藥物反應(yīng)和細胞可塑性中起作用。因此，正如在OC細胞中觀察到的那樣，匹莫齊特增加了CDDP在TNBC細胞中的療效，但在MCF-7細胞中沒有。?

研究結(jié)論：CDDP治療后，一個癌細胞亞群以USP1依賴性的方式上調(diào)Snail，作為一種逃逸機制，導(dǎo)致鉑金抗性和細胞存活率增加，最終增加轉(zhuǎn)移性擴散和疾病復(fù)發(fā)。

?

結(jié)論與討論

????????總之，作者展示了USP1在促進Snail介導(dǎo)的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的新作用。盡管目前USP1抑制劑和其他許多靶向療法一樣，沒有高度的選擇性，因此可能會產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，但作者在這里收集的數(shù)據(jù)有力地表明，在動物模型中，抑制USP1與鉑類化合物相結(jié)合，可以提供一種有效增加鉑類療效的方式。鑒于臨床需要克服OC患者和其他癌癥患者的鉑金耐藥性, 作者相信這種聯(lián)合療法的臨床測試在未來將迅速推進，以改善以鉑金為基礎(chǔ)的化療后復(fù)發(fā)風(fēng)險高的癌癥患者的生存。

?

Thank you!

?

原文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aAV3235