大家好，我是濤濤。第一篇用工具復(fù)現(xiàn)的生信文章，我們就來(lái)無(wú)代碼復(fù)現(xiàn)一篇2020年1月發(fā)表在Frontiers in oncology的一篇4.8分的文章。

瞧，迎面向我們走來(lái)的是“單基因泛癌免疫分析”的文章！

（藏鏡人：這是在開運(yùn)動(dòng)會(huì)嗎？這是什么方陣，怎么我從來(lái)沒有見過(guò)，不明覺厲?。。?/span>（濤濤醬：哈哈，沒錯(cuò)！如果把我們生信比作是一場(chǎng)運(yùn)動(dòng)會(huì)開幕式的話，那么首屈一指的必定是引領(lǐng)時(shí)代潮流的“單基因泛癌分析”了?。?br>
單基因泛癌分析，顧名思義，就是一個(gè)基因在多種腫瘤中的分析。

大家應(yīng)該都有看過(guò)古裝劇吧？拿到“免死金牌”的那個(gè)勇士，可以獨(dú)闖一切皇宮內(nèi)的門禁?！皢位蚍喊┓治觥币彩且粯拥览怼Ｖ灰阏业搅诉@個(gè)特別的基因，也即拿到了這塊“免死金牌”，你就能自如穿梭于各個(gè)腫瘤，在里面恣意馳騁，生出一篇又一篇的高分生信文章！

（藏鏡人：這！么！好！啥也別說(shuō)了，快來(lái)教教如何單基因泛癌分析?。?/span>（濤濤醬：擒賊先擒王，要想做出一篇“單基因泛癌分析”的文章，里面林林種種的生信手段你總得先學(xué)會(huì)吧？）（藏鏡人：蛤？那不就又得花上一年半載的嗎……）（濤濤醬：嘿嘿，這時(shí)候就得隆重推出我們的仙桃生信工具了！不用代碼，不用R語(yǔ)言，只要鼠標(biāo)！只要鼠標(biāo)！泛癌分析帶回家?。?br>
閑話少敘，我們一起來(lái)看一下我們今天的文章題目：Prognostic and Immunological Role of FUN14 Domain Containing 1 in Pan-Cancer: Friend or Foe?

FUN14 Domain Containing 1，簡(jiǎn)稱為FUNDC1。這個(gè)基因在線粒體自噬里面起到了重要作用。作者在這篇文章中，通過(guò)探討FUNDC1在泛癌的預(yù)后以及免疫浸潤(rùn)情況從而論證了FUNDC1基因在腫瘤中的作用。

在“材料和方法”部分，作者開宗明義地闡明了本文實(shí)現(xiàn)的生信手段。

復(fù)現(xiàn)任務(wù)
▲?圖1. FUNDC1在泛癌中的表達(dá)模式
▲?圖2. Kaplan-Meier生存曲線比較了PrognoScan中不同癌癥類型中FUNDC1的高表達(dá)和低表達(dá)
▲?圖3. Kaplan-Meier生存曲線比較了Kaplan-Meier plotter中不同類型癌癥中FUNDC1的高表達(dá)和低表達(dá)
▲?圖4.?具有不同臨床病理特征的肝細(xì)胞癌中FUNDC1 mRNA表達(dá)與OS和PFS的相關(guān)性
▲?圖5. LIHC和LUSC中FUNDC1表達(dá)與免疫浸潤(rùn)水平的相關(guān)性
▲?圖6. FUNDC1表達(dá)與LIHC和LUSC中的B細(xì)胞浸潤(rùn)和巨噬細(xì)胞極化相關(guān)
▲?表1. FUNDC1與TIMER免疫細(xì)胞基因標(biāo)記之間的相關(guān)性
▲?表2. FUNDC1與GEPIA中B細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的基因標(biāo)志物之間的相關(guān)性

復(fù)現(xiàn)工具
◆?仙桃學(xué)術(shù)工具
（https://www.xiantao.love/products）
◆?Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)
（www.oncomine.org）
◆?TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)
（http://timer.cistrome.org/）
◆?GEO數(shù)據(jù)庫(kù)
（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term=）

現(xiàn)在一切準(zhǔn)備就緒，沒時(shí)間解釋了，快上車！跟著我一起開始復(fù)現(xiàn)之旅吧！

?

Figure 1

FUNDC1在泛癌中的表達(dá)模式

在此濤濤想要提醒大家，需要把這兩個(gè)代表圖都深深地記下來(lái)（你存在，我深深的腦海里~）

因?yàn)檫@兩個(gè)圖是典型的Oncomine與Timer的代表圖。至于我們的神仙武器“仙桃”在線工具能不能實(shí)現(xiàn)呢？答案是肯定的，只不過(guò)在不遠(yuǎn)的將來(lái)！我們帥氣的程序員小哥哥正在努力開發(fā)中，我們期待“仙桃學(xué)術(shù)”早日將這兩個(gè)圖的制作收入囊中！

那下面我們就分別來(lái)看看Oncomine與Timer的制作過(guò)程。

第一步：登錄Oncomine的網(wǎng)站，用機(jī)構(gòu)郵箱注冊(cè)并登錄。(https://www.oncomine.org/resource/login.html)

第二步：研究把基因FUNDC1。在search欄中輸入分子FUNDC1，并點(diǎn)擊search按鈕，頁(yè)面自動(dòng)刷新如下。選擇目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行截圖，這樣圖A的結(jié)果就出來(lái)了。

接下來(lái)，我們繼續(xù)復(fù)現(xiàn)Figure 1B。

登錄TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)的網(wǎng)站(http://timer.cistrome.org/)

選擇Exploration，選擇Gene_De，在文字框內(nèi)輸入基因名FUNDC1，點(diǎn)擊submit。

而后獲得以下分析結(jié)果，保存成pdf格式。

最后把Oncomine獲得的結(jié)果與TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到的結(jié)果在Illustrator或者Photoshop軟件中進(jìn)行拼圖，就得到我們的圖1。

或者采用我們仙桃最炙手可熱剛剛“出爐”的拼圖功能喔！（這回程序員小哥哥又開發(fā)了一大利好，那就是可以用自己的圖片來(lái)拼圖啦！）

進(jìn)入仙桃學(xué)術(shù)工具（https://www.xiantao.love/products）；選擇高級(jí)版，點(diǎn)擊“立即使用”（注：免費(fèi)版和基礎(chǔ)版都可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和可視化，由于高級(jí)版功能最全，這里選擇高級(jí)版作為范例）

選擇基礎(chǔ)繪圖 –上傳圖片，點(diǎn)擊進(jìn)入

此處開始上傳自己的圖片，但是記得圖片要為pdf、tiff、tif、png的格式喔！

上傳好之后，可以調(diào)整圖片的寬度和高度參數(shù)，最后點(diǎn)擊確認(rèn)。

記得點(diǎn)擊下方第一個(gè)“保存結(jié)果”按鈕，才能進(jìn)行下一步的拼圖喔！

點(diǎn)擊拼圖工具，進(jìn)入拼圖頁(yè)面。

拖拽目標(biāo)圖片進(jìn)入畫布。（在對(duì)齊圖片的時(shí)候可以選擇橫向參考線和縱向參考線輔助對(duì)齊。兩個(gè)圖片對(duì)齊時(shí)，接近輔助線的時(shí)候還有磁吸功能，拼圖非常便利！

點(diǎn)擊PDF下載，還會(huì)自動(dòng)標(biāo)記字母哦！點(diǎn)擊下載，即可保存成pdf圖片。（小貼士，這里也可以把圖稍微放大，或者兩圖直接的行間距放大，可以在右側(cè)減少留白）

這樣圖就拼好啦！是不是比其他軟件更輕松更便利呢？?（是?。?br>
其實(shí)，關(guān)于圖1B，濤濤醬想說(shuō)的是，仙桃學(xué)術(shù)也可以做得出來(lái)喔，而且效果更精美！

進(jìn)入仙桃學(xué)術(shù)工具，選擇表達(dá)差異（挑）- 非配對(duì)樣本，點(diǎn)擊進(jìn)入。選擇疾病-泛癌。

因?yàn)橛械陌┓N的正常樣本數(shù)不夠，用GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)的正常樣本補(bǔ)足，將TCGA與GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合分析。這里建議選擇XENA-TCGA-GTEx泛癌數(shù)據(jù)。參數(shù)部分的類型選擇-箱圖/柱狀圖，基因輸入FUNDC1。點(diǎn)擊確認(rèn)。

FUNDC1泛癌的結(jié)果就分析出來(lái)啦。保存結(jié)果，點(diǎn)擊大圖，下載pdf文檔。

Figure 2

Kaplan-Meier生存曲線比較了PrognoScan中不同癌癥類型中FUNDC1的高表達(dá)和低表達(dá)

通過(guò)各位看官兒的火眼金睛可以看出，很顯然Figure 2是由多幅不同腫瘤內(nèi)有關(guān)不同結(jié)局指標(biāo)的K-M生存曲線。同樣的道理，這幅圖的實(shí)現(xiàn)也可以有兩種方式。

（濤濤醬：掌握了多種方式實(shí)現(xiàn)，才有助于科研發(fā)展嘛！就好比高中數(shù)學(xué)解題一樣對(duì)吧？）（藏鏡人：好好分享你的文章復(fù)現(xiàn)，別提數(shù)學(xué)，腦殼疼?。?br>
兩種方式分別是：PrognoScan以及仙桃學(xué)術(shù)。

而作為我們?nèi)f能的“仙桃學(xué)術(shù)”，當(dāng)然要放在后位來(lái)介紹啦！

法一：PrognoScan

登入PrognoScan網(wǎng)站（http://dna00.bio.kyutech.ac.jp/PrognoScan/index.html）

別看這個(gè)網(wǎng)站，長(zhǎng)得很簡(jiǎn)陋，其實(shí)有大作用呢！

（濤濤醬：大概就好比懸疑劇最后的大boss 往往都是一開始被大家忽視的小人物？）

在方框內(nèi)輸入感興趣的基因，比如本文的：FUNDC1

點(diǎn)擊“SUBMIT”

（藏鏡人：哇?。。【谷挥心敲炊啵?/span>（濤濤醬：See？你看吧，而且卷動(dòng)鼠標(biāo)往下，還可以看到更多的腫瘤喔?。?/span>

由于Figure 2的圖太多，但類型相似，一一復(fù)現(xiàn)占篇幅，那我們就以Figure 2A來(lái)做一個(gè)示范。

Figure 2A里面作者是探討膀胱癌中FUNDC1與結(jié)局指標(biāo)DSS的關(guān)系。

在其中能找到膀胱癌范圍內(nèi)DSS對(duì)應(yīng)的條目。點(diǎn)擊圖片中間的“PROBE ID”

而后就會(huì)出現(xiàn)

繼續(xù)往下你就能看到我們想要的圖啦！

右鍵保存即可下載至電腦中。

其他幾幅圖同理可得。最后拼圖得到我們的圖2。

法二：仙桃學(xué)術(shù)

進(jìn)入仙桃學(xué)術(shù)工具（https://www.xiantao.love/products）

先復(fù)現(xiàn)圖A。選擇臨床意義（靠）- KM曲線圖，點(diǎn)擊進(jìn)入

選擇TCGA-BLCA, FPKM, 分子輸入FUNDC1，預(yù)后類型選擇DSS，點(diǎn)擊確認(rèn)。得到以下的結(jié)果。保存結(jié)果。

但是在這里需要提醒大家的一點(diǎn)是，仙桃學(xué)術(shù)KM曲線圖的部分目前的數(shù)據(jù)是來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的喔，而本文作者的數(shù)據(jù)是來(lái)自GEO。在不久的未來(lái)，仙桃學(xué)術(shù)也會(huì)為大家提供GEO的數(shù)據(jù)，大家再耐心等等，多多轉(zhuǎn)發(fā)文章讓程序員小哥哥加雞腿，這樣他們就有動(dòng)力啦！

Figure 3

Kaplan-Meier生存曲線比較了Kaplan-Meier plotter中不同類型癌癥中FUNDC1的高表達(dá)和低表達(dá)

這幅圖和圖二其實(shí)沒什么區(qū)別，就是用Kaplan-Meier生存曲線做出來(lái)的圖而已。所以其實(shí)這也給我們提供了另一個(gè)解題思路，除了上述的兩種方法之外，我們還有第三種方法——Kaplan-Meier Plot。

復(fù)現(xiàn)步驟：

打開Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站（http://www.kmplot.com/analysis/）

跟著我，點(diǎn)擊如下按鈕。

這里可以選擇21種腫瘤（包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌及胃癌）超過(guò)54000個(gè)基因（mRNA, miRNA, 蛋白）進(jìn)行生存分析。其數(shù)據(jù)主要來(lái)源于GEO、EGA和TCGA。只有你想不到，沒有你沒想到！

緊接著，在方框里輸入我們要復(fù)現(xiàn)的FUNDC1，選擇分析的結(jié)局指標(biāo)OS，而后勾選不同的癌種，最后點(diǎn)擊下圖的分析按鈕。

真的是一鍵出圖！要多神奇就有多神奇！

最后把這些圖放在Illustrator或者Photoshop軟件中進(jìn)行拼圖，就得到我們的圖3。

最后還可以將圖片保存成PDF格式。

依次同理可以復(fù)現(xiàn)Figure 3的其他圖片。

Figure 4

具有不同臨床病理特征的肝細(xì)胞癌中FUNDC1 mRNA表達(dá)與OS和PFS的相關(guān)性

這個(gè)圖是典型的多因素Cox回歸分析的森林圖結(jié)果。

總體復(fù)現(xiàn)思路應(yīng)該如此概括，先進(jìn)行多因素的臨床變量與預(yù)后結(jié)局關(guān)聯(lián)的Cox回歸分析，再構(gòu)建森林圖。

有了這個(gè)思路，復(fù)現(xiàn)就不難做到啦！步驟如下：

第一步：多因素的臨床變量與預(yù)后結(jié)局關(guān)聯(lián)的Cox回歸分析

選擇臨床意義（靠）- 單因素|多因素Cox回歸，點(diǎn)擊進(jìn)入

選擇TCGA-LIHC , FPKM, 分子輸入FUNDC1，采用默認(rèn)的預(yù)后類型（overall survival）。在左側(cè)框里選擇臨床變量，或者輸入基因名（可以填一個(gè)或多個(gè)基因名），在右側(cè)框可里選擇亞組變量，包括FUNDC1基因表達(dá)的Low或者High等變量。

如果需要再增加變量，點(diǎn)擊右側(cè)的加號(hào)；如果需要剔除某個(gè)變量，需要在變量的右側(cè)點(diǎn)擊減號(hào)。確定好臨床變量和分組信息后，點(diǎn)擊確認(rèn)。會(huì)分析出統(tǒng)計(jì)分析表，以及統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)、相應(yīng)的材料與方法、結(jié)果部分的描述。

進(jìn)一步保存成word文檔和excel結(jié)果。分析結(jié)果如下。

第二步：基于以上表格，制作森林圖結(jié)果

選擇基礎(chǔ)繪圖 - 森林圖，點(diǎn)擊進(jìn)入

目前仙桃學(xué)術(shù)生信工具并沒有針對(duì)單基因的森林圖分析。需要根據(jù)多因素Cox回歸分析的結(jié)果進(jìn)行整理。

基礎(chǔ)繪圖—分組比較—森林圖

點(diǎn)擊下載示例數(shù)據(jù)，看一下示例數(shù)據(jù)的格式。需要把多因素cox回歸分析結(jié)果整理成以下形式。

將之前cox回歸分析的excel結(jié)果刪除B、C列單因素分析結(jié)果，只保留多因素cox分析結(jié)果。

點(diǎn)擊excel文件上傳。為了避免森林圖過(guò)寬，字體重疊，把寬度調(diào)整為15cm（先點(diǎn)擊確認(rèn)，如果字體重疊，再回來(lái)擴(kuò)大寬度的厘米數(shù)，直到森林圖字體不重疊為止）。點(diǎn)擊確認(rèn)。

圖片行內(nèi)字?jǐn)?shù)過(guò)寬，需要橫拉條拉動(dòng)才能看全頁(yè)面。這時(shí)候選擇“查看大圖”。

得到結(jié)果如下。由此森林圖復(fù)現(xiàn)出來(lái)了。

Figure 5

LIHC和LUSC中FUNDC1表達(dá)與免疫浸潤(rùn)水平的相關(guān)性

圖A是在LIHC肝細(xì)胞癌中，F(xiàn)UNDC1的表達(dá)與各類免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)聯(lián)程度，其中第一張圖是B細(xì)胞。我們就示范復(fù)現(xiàn)一下圖A的第一張圖。

同樣也是兩個(gè)方法：TIMER 以及 仙桃！

法一：TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)(http://timer.cistrome.org/)

選擇Immune Association里面的Gene

而后，在方框里選擇基因FUNDC1以及需要探究的免疫細(xì)胞。

然后，點(diǎn)擊“submit”！可以看到以下結(jié)果

找到你想要的腫瘤類型與細(xì)胞亞型，此處為L(zhǎng)IHC與B cell。鼠標(biāo)點(diǎn)擊這個(gè)數(shù)值。

而后就能出圖啦！

其他方法依次類推，最后將結(jié)果拼圖就得到我們的圖5。

法二：仙桃學(xué)術(shù)

選擇交互網(wǎng)絡(luò)（聯(lián)）–免疫浸潤(rùn)—散點(diǎn)圖，點(diǎn)擊進(jìn)入

接下來(lái)左側(cè)選擇TCGA-LIHC，F(xiàn)PKM，右側(cè)參數(shù)的分子部分選擇感興趣的基因，而算法參數(shù)選擇要研究的細(xì)胞，此處選擇B cells。

最后，點(diǎn)擊“確認(rèn)”，就能一鍵出圖啦！

Table 1

FUNDC1與TIMER免疫細(xì)胞基因標(biāo)記之間的相關(guān)性

（藏鏡人：我的天啊，這表格也太大了吧，里面都是些什么數(shù)字啊，看得云里霧里的?。?br>

細(xì)心的你一定能夠發(fā)現(xiàn)，這個(gè)圖其實(shí)就是圖5各個(gè)細(xì)胞的Spearman r值與p值的匯總??！

所以運(yùn)用圖5介紹的Timer或我們的仙桃，就能做出這一幅“曠世巨作”喔！

Figure?6

FUNDC1表達(dá)與LIHC和LUSC中的B細(xì)胞浸潤(rùn)和巨噬細(xì)胞極化相關(guān)

聰明的你一定也發(fā)現(xiàn)了吧？圖6和圖5其實(shí)是一模一樣的，只是其中研究浸潤(rùn)的是不同細(xì)胞而已，所以直接參照前文的圖5就可以依樣畫瓢地如法炮制啦！

Table 2

FUNDC1與GEPIA中B細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的基因標(biāo)志物之間的相關(guān)性

表2與表1也是一個(gè)道理的喔！

（藏鏡人：可是我看到這里，前面的又忘了欸 o(╥﹏╥)o ）（濤濤醬：如果前面所說(shuō)的Timer或者仙桃免疫浸潤(rùn)散點(diǎn)圖還不會(huì)的話，趕緊往上滑回去再多看幾眼喔?。?br>
恭喜你看到這里，也就意味著你已經(jīng)掌握了復(fù)現(xiàn)單基因泛癌免疫分析的一大半了！

（藏鏡人：蛤？那另一半在哪呢？）（濤濤醬：哈哈，另一半就是立刻登陸仙桃學(xué)術(shù)

開始實(shí)操吧?。?/span>