2022年7月，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院范先群課題組在?Journal of Experimental & Clinical Cancer Research?發(fā)表了題名為“Proteotranscriptomics of ocular adnexal B-cell lymphoma reveals an oncogenic role of alternative splicing and identifies a diagnostic marker”的研究論文，該研究利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)以及其它技術(shù)手段提供了一個(gè)綜合的基因表達(dá)譜，并證明了高全局蛋白質(zhì)-mRNA一致性是眼附屬器 B 細(xì)胞淋巴瘤（OABL）的預(yù)后相關(guān)分子特征，此外，作者還描繪了 OABL 的選擇性剪接事件景觀，并揭示了 ADAR 的致癌作用。該研究中的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和 TMT 蛋白組服務(wù)由博奧晶典提供。

【發(fā)表期刊】Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

【發(fā)布時(shí)間】2022年7月

【影響因子】12.658

01

研究路線

02

研究背景

淋巴瘤是起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤。根據(jù)瘤細(xì)胞分為非霍奇金淋巴瘤（NHLs）和霍奇金淋巴瘤（HLs）兩類(lèi)。眼附屬器淋巴瘤 (OAL) 是一種罕見(jiàn)的惡性淋巴增生，占 NHLs 的 1-2%。OALs 常出現(xiàn)在結(jié)膜、眼瞼和眼眶，還有淚腺等部位。大多數(shù) OALs 是 B 細(xì)胞淋巴瘤。結(jié)外邊緣區(qū) B 細(xì)胞淋巴瘤 (EMZL) 是 OABL 最常見(jiàn)的亞型 (55–69%)，其次是彌漫性大 B 細(xì)胞淋巴瘤 (DLBCL) (10–15%)。近年來(lái)，雖然 NHLs 的研究已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了突破性進(jìn)展，但對(duì) OABL 的研究很少。

03

研究結(jié)果

1. OABL 的綜合蛋白轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜

作者按照研究路線中的流程來(lái)進(jìn)行 OABL 的研究。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中的高可變基因 (HVGs) 和樣本進(jìn)行層次聚類(lèi)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù) OABLs 和對(duì)照分為兩組。在去除低豐度轉(zhuǎn)錄物/蛋白質(zhì)后，將轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)映射到 Ensembl ID，并在這些樣本中檢測(cè)到 3639 個(gè)蛋白質(zhì)-mRNA 對(duì)。對(duì)于這些蛋白質(zhì)-mRNA 對(duì)，計(jì)算了 OABLs 和對(duì)照之間的差異表達(dá)基因（DEGs）（圖 1B）。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，OABLs 蛋白質(zhì)組中有 787 個(gè)基因上調(diào)，542 個(gè)基因下調(diào)；OABLs 轉(zhuǎn)錄組中 806 個(gè)基因上調(diào)，445 個(gè)基因下調(diào)。通過(guò)組學(xué)數(shù)據(jù)匹配結(jié)果，發(fā)現(xiàn) 451 個(gè)基因一致上調(diào)（CO-UP），386 個(gè)基因一致下調(diào)（CO-DOWN )。CO-UP DEGs 主要富集于免疫相關(guān)、GTPase 信號(hào)、磷酸鹽代謝過(guò)程的負(fù)調(diào)控和 DNA 重組等 GO 條目。CO-DOWN DEGs 主要富集于正常組織發(fā)育、一元羧酸、精氨酸和脯氨酸代謝等 GO 條目（圖1C）。

為了避免研究的潛在系統(tǒng)偏差，作者進(jìn)一步進(jìn)行 GSEA 分析以識(shí)別 OABLs 中重疊的失調(diào)基因集。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)鑒定出總共 1023 個(gè)基因集。其中，763 個(gè)基因集在至少一種類(lèi)型的組學(xué)中顯著失調(diào)，725 個(gè)基因集一致失調(diào)（圖1D）。根據(jù)每個(gè)組學(xué)中 NES 等級(jí)的總和排列，CO-UP 基因集主要富集于 mRNA 加工和剪接、DNA 損傷和修復(fù)以及蛋白質(zhì)蘇木化等條目。CO-DOWN 基因集主要富集于正常組織發(fā)育，以及有氧葡萄糖代謝等條目（圖1E）。

2、全局蛋白質(zhì)-mRNA 一致性是 OABL 的遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)相關(guān)特征

接下來(lái)，作者檢查了蛋白質(zhì)和 mRNA 豐度之間的關(guān)系及其與疾病特征的關(guān)聯(lián)。全局蛋白質(zhì)-mRNA 一致性計(jì)算為每位患者所有配對(duì)蛋白質(zhì)和 mRNA 豐度的 Spearman 相關(guān)結(jié)果（圖2A）?？紤]到 OABLs 和對(duì)照之間不同的轉(zhuǎn)錄本/蛋白質(zhì)豐度分布，分別分析了這兩組中的蛋白質(zhì)-mRNA 對(duì)。在 OABLs中鑒定出 3818 對(duì)蛋白質(zhì)-mRNA 對(duì)，在對(duì)照中鑒定出 3728 對(duì)。OABLs 的一致性顯著高于對(duì)照組（圖2B-C）。考慮到炎癥和淋巴瘤之間的關(guān)聯(lián)，比較了亞組樣本的全局一致性。結(jié)果表明，OABLs 表現(xiàn)出比其他組更高的一致性。這些數(shù)據(jù)表明，蛋白質(zhì)和 mRNA 豐度之間的相關(guān)性增加是 OABLs 的疾病相關(guān)特征。作者接下來(lái)分析了蛋白質(zhì)-mRNA 一致性是否與疾病侵襲性有關(guān)。比較了亞型、Ann Arbor 分期和預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素之間的一致性（圖2D）。結(jié)果顯示，無(wú) EMZL 亞型的一致性顯著高于 EMZL 亞型，高一致性與較高的 LDH 和 IPI 兩個(gè) NHLs 預(yù)后危險(xiǎn)因素顯著相關(guān)，另外，高一致性還與較高的 Ann Arbor 階段相關(guān)。接下來(lái)，測(cè)試了蛋白質(zhì)-mRNA 一致性與 OABL 預(yù)后之間的相關(guān)性。作者使用一致性的中值將 OABL 患者分為兩組，生存分析顯示，OABL 的全局一致性增加與 DRFS 降低顯著相關(guān)。然后，比較了有和沒(méi)有復(fù)發(fā)事件的患者之間的全局一致性（圖2F）。高一致性與遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)事件顯著相關(guān)，但與局部復(fù)發(fā)事件無(wú)關(guān)。隨后，作者繼續(xù)研究了異常上調(diào)的全局蛋白質(zhì)-mRNA 一致性的潛在調(diào)節(jié)劑和生物學(xué)意義。因?yàn)槿忠恢滦允且粋€(gè)內(nèi)在的連續(xù)變量，作者檢查了 GSVA 結(jié)果與一致性之間的相關(guān)性（圖 2H）。在前 20 個(gè)正相關(guān)基因集中，有 8 個(gè)基因集是 TP53 相關(guān)基因集，其余大部分是免疫相關(guān)基因集。這些發(fā)現(xiàn)表明，增加的整體蛋白-mRNA 一致性是 OABLs 的一個(gè)新分子特征，與疾病侵襲性和更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，OABL 中這種異常上調(diào)的一致性與 TP53 通路呈正相關(guān)。

3、趨勢(shì)分析將選擇性剪接確定為 OABL 的炎癥獨(dú)立特征

在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中，作者通過(guò)層次聚類(lèi)、主成分分析和全局蛋白質(zhì)-mRNA 一致性觀察到炎癥和 OABL 樣本之間分子特征的相似性（圖2C，圖3A-B）。先前研究表明，NFκB 信號(hào)通路在炎癥和 NHLs 中激活，作者在跨亞組的 NFκB 信號(hào)通路中進(jìn)行了層次聚類(lèi)（圖3C），NFκB 相關(guān)基因的豐度逐漸增加，從正常到炎癥再到 OABLs，這與之前的報(bào)道一致。隨后，作者通過(guò)對(duì)正常、炎癥和 OABL 組的監(jiān)督和非監(jiān)督聚類(lèi)基因在蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中構(gòu)建了一個(gè)炎癥-OABL 特征。作者對(duì)每?jī)山M之間的蛋白質(zhì)豐度進(jìn)行了 t 檢驗(yàn)，并假設(shè)了九種失調(diào)的基因模式（圖 3F），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)由上調(diào)模式構(gòu)成。結(jié)合 k-means 聚類(lèi)和 t 檢驗(yàn)基因模式的結(jié)果，作者確定了五個(gè)基因簇：炎癥模擬上調(diào)基因（MIMIC-UP）、模糊上調(diào)基因（VAGUE-UP）、OABL 特異性上調(diào)基因（SPECIFIC-UP） ，炎癥模擬下調(diào)基因（MIMIC-DOWN）和 OABL 特異性下調(diào)基因（SPECIFIC-DOWN）（圖3G）。因?yàn)樯险{(diào)的基因構(gòu)成了大多數(shù)聚集蛋白，作者專(zhuān)注于 MIMIC-UP 和 SPECIFIC-UP，它們代表了極其不同的失調(diào)模式。MIMIC-UP 主要富含免疫相關(guān)基因集，而 SPECIFIC-UP 主要富含與 mRNA 代謝和剪接、DNA 損傷和代謝以及染色質(zhì)重塑相關(guān)的基因集（圖 3H）。這些結(jié)果清楚地表明，炎癥組和 OABLs 組之間的相似性不僅存在于 NFκB 途徑中，還存在于更大的免疫環(huán)境中。另外，作者確定了 OABL 中特異性失調(diào)的基因集，包括 mRNA 剪接和與惡性腫瘤發(fā)展相關(guān)的途徑（DNA 損傷、染色質(zhì)重塑）。

4、選擇性剪接及其調(diào)節(jié)器可能影響 OABL 的發(fā)展和進(jìn)展

選擇性剪接在 OABL 中起著重要作用。研究結(jié)果揭示了 OABLs 中炎癥獨(dú)立模式中的可變剪接失調(diào)（圖1E，3H）。據(jù)報(bào)道，選擇性剪接與惡性腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)。因此，作者假設(shè)可變剪接可能在 OABL 中發(fā)揮致癌作用。

接下來(lái)，作者構(gòu)建了一個(gè)工作流程來(lái) 1）評(píng)估原始 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)并與對(duì)照相比識(shí)別 OABL 的異常選擇性剪接事件（AASE）；2) 聯(lián)合臨床數(shù)據(jù)以識(shí)別與預(yù)后相關(guān)的 AASE；3）結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)研究潛在的剪接調(diào)節(jié)因子和 AASE 的生物學(xué)功能（圖4A）。分析了五種類(lèi)型的選擇性剪接事件（ASE）：替代 3' 剪接位點(diǎn) (A3)、替代 5' 剪接位點(diǎn) (A5)、互斥外顯子 (MX)、保留內(nèi)含子 (RI) 和跳躍外顯子 (SE)，共鑒定出 1806 個(gè) AASEs。這些 AASEs 總共影響了 916 個(gè)基因，其中大多數(shù)受 SE 影響（圖4C）。在 916 個(gè) AASEs 相關(guān)基因中，651 個(gè)基因僅受一種 ASE 的調(diào)節(jié)，而其余基因則受多種 ASEs 的影響（圖4B）。

隨后，研究了 AASE 的生物學(xué)意義。AASE 相關(guān)基因富集在細(xì)胞骨架、Rho GTPase 和細(xì)胞器相關(guān)條目（圖4D）。然后，通過(guò)將 AASE Inclevel 與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的 GSVA 結(jié)果相關(guān)聯(lián)來(lái)分析潛在的牽連生物學(xué)功能（圖4E）。在列出的前 20個(gè) 基因集中，有 8 個(gè)與 DNA 損傷和細(xì)胞周期有關(guān)。這些數(shù)據(jù)共同表明 AASE 廣泛存在于 OABL 中并與預(yù)后相關(guān)，表現(xiàn)出選擇性剪接的基因與 OABL 中失調(diào)的基因集有關(guān)。AASE 與關(guān)鍵的生物學(xué)功能相關(guān)，如 DNA 損傷和細(xì)胞周期，這可能意味著它們充當(dāng)這些過(guò)程的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑。

5、ADAR 是 OABL 中選擇性剪接的核心調(diào)節(jié)因子，影響關(guān)鍵生物學(xué)功能

ADAR 是作用于 RNA 酶家族的腺苷脫氨酶的成員，可催化雙鏈 RNA 中的腺苷編輯為肌苷。在相關(guān)性分析中，作者發(fā)現(xiàn) ADAR 是與 AASE 和進(jìn)展相關(guān) AASE 相聯(lián)系的高頻剪接因子（SF）（圖 4F，H）。作者接下來(lái)研究了與 ADAR 相關(guān)的潛在生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn) ADAR 的蛋白質(zhì)豐度與影響 145 個(gè)基因的 280 個(gè) AASEs 密切相關(guān)。這些基因大多富含 Rho GTPase 相關(guān)基因集（圖5A），這是腫瘤起始和進(jìn)展中細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的重要基因集和關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了進(jìn)一步檢查 ADAR 的作用，作者在 11 組 ADAR 敲低 (KD)、敲除或過(guò)表達(dá)癌細(xì)胞系中鑒定了 AASE。共有 1472 個(gè)基因反復(fù)受到 ADAR 調(diào)節(jié)的 AASE 的影響。這些基因也富含 Rho GTPase 相關(guān)基因集（圖5B）。因?yàn)槭苡绊懙幕蚋缓蛲龊驮鲋诚嚓P(guān)基因集（圖5A，B），作者研究了 ADAR 和 MKI67 之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADAR 蛋白豐度與 MKI67 呈正相關(guān)（圖5C）。為了驗(yàn)證假設(shè)的調(diào)節(jié)作用，作者建立了 ADAR KD NHL 細(xì)胞系。與對(duì)照細(xì)胞相比，ADAR KD 細(xì)胞系表現(xiàn)出顯著降低的細(xì)胞增殖（圖5E）。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) ADAR KD 使 NHL 細(xì)胞系對(duì) Rho GTPase 抑制劑敏感。Rho GTPase 抑制劑在處理 72 小時(shí)后的 IC50 在 ADAR KD 細(xì)胞系中低于對(duì)照（圖5F）。這些結(jié)果表明，ADAR 是 OABL 中可變剪接的核心調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和對(duì) Rho GTPase 抑制劑的敏感性。

6、蛋白質(zhì)組學(xué)分析將 DNAJC9 鑒定為 EMZL 的診斷標(biāo)志物

OABL 的病理診斷仍然很困難。因此，作者檢查了蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)以研究 OABL 的潛在診斷標(biāo)志物。生物標(biāo)志物檢測(cè)的工作流程如圖6A 所示。為了篩選生物標(biāo)志物，首先通過(guò)單變量邏輯回歸確定了 98 種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)和 98 種重要的蛋白質(zhì)。接下來(lái)，將 85 個(gè)重疊的蛋白質(zhì)納入 lasso 懲罰回歸模型，通過(guò) 200 次交叉驗(yàn)證迭代分析得到 4 種蛋白質(zhì)（DNAJC9、TFEB、SUMO3 和 MBD1）。然后對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行逐步邏輯回歸，DNAJC9 是唯一確定的蛋白質(zhì)。為了驗(yàn)證結(jié)果，分析了各組 DNAJC9 的蛋白質(zhì)豐度（圖6B）。與對(duì)照組、IOI 和 RLH 組相比，OABLs 中的 DNAJC9 豐度顯著更高。與對(duì)照相比，OABL 所有亞型的 DNAJC9 豐度也顯著升高。與傳統(tǒng)的診斷標(biāo)志物 CD20 和 PAX5 相比，DNAJC9 表現(xiàn)出相對(duì)較高的 AUC 值（圖 6C）。接下來(lái)，作者研究了 DNAJC9 在患者 FFPE 樣本中的診斷性能。選擇 EMZL 和 DLBCL（OABL 的兩個(gè)主要亞型）作為實(shí)驗(yàn)組，炎癥樣本作為對(duì)照。亞細(xì)胞定位分析表明，DNAJC9 定位于 OABLs 的細(xì)胞核和炎癥組織的淋巴區(qū)域。在 OABL 的癌旁部位和炎癥的腺體區(qū)域中，DNAJC9 定位于細(xì)胞質(zhì)中。大多數(shù) DNAJC9 在淋巴區(qū)域和 OABL 的同一細(xì)胞中與 CD20 共表達(dá)（圖 6D-E）。與對(duì)照組相比，EMZLs 和 DLBCLs 中 DNAJC9 的 MFI 顯著升高。與炎癥相比，OABLs 中 CD20 的 MFI 并不高（圖 6E）。IHC 分析顯示，與炎癥相比，EMZL 中大塊細(xì)胞和細(xì)胞核的 DNAJC9 染色評(píng)分均顯著高于對(duì)照（圖 6F-G）。對(duì)于 DLBCLs，大塊細(xì)胞的染色評(píng)分與對(duì)照相比沒(méi)有顯著提高，而與 EMZLs 相比，細(xì)胞核的染色評(píng)分顯著降低。這些結(jié)果表明，DNAJC9，尤其是 DNAJC9 的強(qiáng)核染色，是一種潛在的 EMZL 病理診斷標(biāo)志物，可以區(qū)分 EMZL 和炎癥。

04

研究結(jié)論

該研究提供了一個(gè)綜合的基因表達(dá)譜，并證明了高全局蛋白質(zhì)-mRNA 一致性是 OABL 的預(yù)后相關(guān)分子特征。作者描繪了 OABL 的選擇性剪接事件景觀，并揭示了 ADAR 的致癌作用，另外，還將 DNAJC9 的強(qiáng)核染色鑒定為結(jié)外邊緣區(qū)淋巴瘤的有希望的病理學(xué)診斷生物標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)：

Shi J, Zhu T, Lin H, Liu Z, Zhou M, Yu Z, Zhou X, Song X, Wang Y, Jia R, Fan X, Zhou Y. Proteotranscriptomics of ocular adnexal B-cell lymphoma reveals an oncogenic role of alternative splicing and identifies a diagnostic marker.?J Exp Clin Cancer Res. 2022 Jul 30;41(1):234.