1. 為什么要做qPCR引物驗證：節(jié)約時間以及試劑成本，避免做了大量樣品結(jié)果分析時不可用；避免珍貴的樣品被浪費，可以將引物驗證好了再做；

2. qPCR引物驗證的方法：取普通的cDNA直接跑qPCR驗證引物的可用性；普通梯度PCR+瓊脂糖凝膠電泳驗證引物的特異性；

3. qPCR預(yù)混反應(yīng)體系（單一反應(yīng)體系）：

4. 上樣：用排槍將預(yù)混液按15μL/孔準確加入96孔板中；然后用排槍準確加入5μL樣本（制備的cDNA模板可稀釋后使用），總反應(yīng)體系為20μL；每個樣本各設(shè)3個復(fù)孔；

5. cDNA原液50ng/ul，稀釋10倍后，上樣5ul（25ng）;

6. 對照：引物對照（引物，Mix，H2O）,陰性對照（水，Mix）;

7. 待驗證引物：

一般從文獻中找到之后，可以在NCBI中，先Primer Blast一下，看一下引物是否是特異性的，一般blast結(jié)果中顯示是一個基因，或者是同一個基因的不同轉(zhuǎn)錄本，或者有別的基因出現(xiàn)，但product大于500bp以上，就表示該引物是特異性的，可以用；但如果有很多不同基因名的小片段（小于300bp），就表示不可用，可以排除了；

blast過的引物：

8. 板布局：

9. 加樣

10. 實驗結(jié)果分析以及結(jié)果判讀：

?? 根據(jù)qPCR結(jié)果中的CT值，水模板是否起峰；

?? 擴增曲線，是否擴增，擴增曲線是否正常；

?? 溶解曲線，是否為單一峰，是否為非特異性擴增；

注：以上是我自己做qPCR之前會做的引物驗證的實驗流程，如果有幫助的話，算我沒白敲，hhhh