細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

是最基本、最普遍的生物分析手段之一，從細(xì)胞形態(tài)、定位、生長(zhǎng)趨勢(shì)、功能及相互作用等方向提供生物學(xué)信息。自從1674年Anton van Leeuwenhoek通過(guò)基礎(chǔ)顯微鏡首次觀察到活細(xì)胞以來(lái)，活細(xì)胞分析技術(shù)不斷更新迭代，并在生物醫(yī)學(xué)界的進(jìn)步和發(fā)展中發(fā)揮著舉足輕重的作用。隨著醫(yī)藥大健康成為國(guó)家戰(zhàn)略，高校院所、生物技術(shù)公司及制藥企業(yè)等研究人員均在基礎(chǔ)生命科學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行更廣泛和更深入的研究。

培養(yǎng)箱能夠保證穩(wěn)定的CO2和濕度等要求，確保適合的細(xì)胞培養(yǎng)條件，使細(xì)胞處于最佳生長(zhǎng)狀態(tài)。常規(guī)的細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)需要頻繁進(jìn)出細(xì)胞間，將細(xì)胞拿出培養(yǎng)箱用顯微鏡進(jìn)行觀察后再放回培養(yǎng)箱?？墒谴嬖诘膯?wèn)題也是顯而易見(jiàn)的：

錯(cuò)失細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化：細(xì)胞的行為是動(dòng)態(tài)的，細(xì)胞群體變化、結(jié)構(gòu)和功能變化可能在很長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)發(fā)生。單個(gè)時(shí)間的終點(diǎn)檢測(cè)是片面的，甚至不可靠。

脆弱的細(xì)胞，培養(yǎng)不易，易受干擾：如敏感的神經(jīng)細(xì)胞、干細(xì)胞、原代細(xì)胞等，易受到干擾，應(yīng)該盡量減少移動(dòng)，避免固定和清洗步驟等，盡量維持一個(gè)穩(wěn)定的生理環(huán)境。

細(xì)胞分析復(fù)雜困難：常見(jiàn)的各類成像分析軟件，操作復(fù)雜，步驟多，甚至需要深入的專業(yè)知識(shí)。

賽多利斯推出Incucyte?實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)，可以置于培養(yǎng)箱中直接對(duì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、連續(xù)的長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)，確保細(xì)胞免受干擾，并將細(xì)胞的“精彩故事”變成mini電影呈現(xiàn)出來(lái)，提供更生動(dòng)、更有趣的細(xì)胞洞察。
目前有超過(guò)13000篇相關(guān)文獻(xiàn)均使用Incucyte?系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)研究，其中CNS頂刊超過(guò)200篇，廣泛涉及腫瘤、免疫、藥物開發(fā)、代謝、干細(xì)胞、再生醫(yī)學(xué)、疾病感染等諸多領(lǐng)域，涵蓋了細(xì)胞增殖、遷移/劃痕/趨化、細(xì)胞毒性、凋亡、侵襲、細(xì)胞殺傷、3D腫瘤球、神經(jīng)生長(zhǎng)等多種應(yīng)用。

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在此，我們甄選出五篇使用Incucyte?的高引CNS文章，詳細(xì)介紹實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析技術(shù)的典型應(yīng)用。

1

Science：免疫細(xì)胞殺傷
應(yīng)用領(lǐng)域：腫瘤學(xué)

約翰霍普金斯大學(xué)的Shibin Zhou等人[1]開發(fā)出一種靶向TP53突變基因的雙特異性單鏈抗體H2-scDb。采用Incucyte?的NucLight green快速染料標(biāo)記1 × 104個(gè)TYK-nu細(xì)胞，96孔板放置4h，然后加入2 × 104個(gè)或5 × 104個(gè)T細(xì)胞和激活劑scDb（anti-CD3ε scFv，單鏈雙特異性抗體形式）進(jìn)行共培養(yǎng)。不斷減少的綠色熒光信號(hào)，表明激活的T細(xì)胞具有顯著的免疫殺傷作用。同時(shí)，通過(guò)Incucyte?系統(tǒng)的10×物鏡連續(xù)拍攝120h，計(jì)算每孔中每mm2的gfp陽(yáng)性對(duì)象數(shù)量，發(fā)現(xiàn)H2-scDb介導(dǎo)的細(xì)胞毒性同樣通過(guò)TP53的破壞而減輕。

2

Nature：神經(jīng)細(xì)胞吞噬及分化

應(yīng)用領(lǐng)域：神經(jīng)科學(xué)研究

中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）損傷和疾病會(huì)強(qiáng)烈誘導(dǎo)星形膠質(zhì)（Astrocytes）細(xì)胞通過(guò)增生可形成膠質(zhì)“瘢痕”。斯坦福大學(xué)Shane A. Liddelow等人[2]研究發(fā)現(xiàn)了一種星形膠質(zhì)細(xì)胞亞型（A1）。A1由激活的小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)分泌Il-1α、TNF和C1q誘導(dǎo)生產(chǎn)，并參與多種神經(jīng)退行性疾病，包括阿爾茨海默氏癥、亨廷頓氏癥和帕金森氏癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥和多發(fā)性硬化癥。A1沒(méi)有促進(jìn)神經(jīng)元生存、生長(zhǎng)、突觸發(fā)生和吞噬的能力，但可以誘發(fā)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的死亡。當(dāng)阻斷A1的形成時(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的死亡被阻止了。這為神經(jīng)退行性疾病的新療法提供機(jī)會(huì)。此研究中研究人員通過(guò)pHrodo red染料突觸小體及髓鞘碎片來(lái)研究大鼠神經(jīng)細(xì)胞Astrocytes對(duì)其的吞噬能力。在Incucyte?的20×物鏡從24孔板中獲取9張圖像，檢測(cè)比較吞噬能力。同時(shí)還在明場(chǎng)視野下監(jiān)控OPCs (oligodendrocyte precursor cells)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化過(guò)程。

3

Nature：劃痕實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞遷移

應(yīng)用領(lǐng)域：轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)

傷口愈合涉及細(xì)胞遷移、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)重塑，以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）的刺激。其中角質(zhì)細(xì)胞（Keratinocyte）的遷移和上皮形成對(duì)傷口愈合至關(guān)重要。新加坡國(guó)立大學(xué)Prabha Sampath等人研究發(fā)現(xiàn)[3]，microRNA-198 (miR-198)表達(dá)后會(huì)通過(guò)靶向和抑制DIAPH1, PLAU 以及LAMC2來(lái)抑制角質(zhì)細(xì)胞遷移，而FSTLI恰好相反，能夠促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞遷移。TGF-β1作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)開關(guān)，能夠通過(guò)降低KSRP(KH型剪接調(diào)節(jié)蛋白)的產(chǎn)生來(lái)抑制miR-198的生成，并間接促進(jìn)FSTL1的表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)為改善病人傷口愈合療法提供新的途徑。在此研究中，Incucyte?被用于劃痕實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞遷移的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。角質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，使用Incucyte? wound maker制造劃痕，用Incucyte?拍照監(jiān)測(cè)創(chuàng)傷愈合情況。上圖和視頻分別為不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA以及fstl1特異性siRNA的細(xì)胞遷移圖像(n=5)。在24h時(shí)，對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞的傷口完全愈合，而敲除FSTL1后細(xì)胞的傷口僅愈合15±5%。Incucyte?監(jiān)測(cè)過(guò)表達(dá)的對(duì)照miRNA角質(zhì)細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)Incucyte?監(jiān)測(cè)過(guò)表達(dá)的miR-198角質(zhì)細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)視頻來(lái)源：Sundaram, G., et al. Nature?2013, 495, 103–106

4

Cell：細(xì)胞毒性及細(xì)胞凋亡

應(yīng)用領(lǐng)域：免疫學(xué)

RIPK3（受體相互作用蛋白激酶-3）激活MLKL，導(dǎo)致質(zhì)膜（PM）破壞和一種受調(diào)控的壞死性凋亡。St. Jude兒童研究醫(yī)院的Douglas R. Green等人[4]?發(fā)現(xiàn)激活MLKL導(dǎo)致破碎的、帶有暴露的磷脂酰絲氨酸（PS）的PM氣泡產(chǎn)生，這些氣泡從原本完整的細(xì)胞表面釋放出來(lái)。ESCRT-III機(jī)制是形成這些氣泡的必要條件，當(dāng)MLKL的激活受到限制或被逆轉(zhuǎn)時(shí)，它能維持細(xì)胞的生存。在壞死細(xì)胞死亡的條件下，ESCRT-III控制質(zhì)膜完整持續(xù)的時(shí)間。由于ESCRT-III的作用，壞死細(xì)胞可以表達(dá)趨化因子和其他調(diào)節(jié)分子，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的抗原交叉刺激。研究人員通過(guò)將Sytox-Green標(biāo)記的L929細(xì)胞死亡刺激物轉(zhuǎn)染到L292細(xì)胞中，用Incucyte?監(jiān)控不同時(shí)間點(diǎn)以及不同抑制劑的情況下的細(xì)胞死亡情況（% SytoxGreen），并確認(rèn)ESCRT-III可以對(duì)抗壞死性凋亡（Necroptosis）。

5

Nature：細(xì)胞增殖

應(yīng)用領(lǐng)域：病毒學(xué)

德國(guó)BioNTech公司的Ugur Sahin等人[5]開發(fā)的BNT162b2是全球首個(gè)上市的mRNA新冠疫苗，并取得了顯著的治療效果。在該疫苗的臨床前研究中，采用Incucyte?系統(tǒng)建立了假病毒血清抑制試驗(yàn)。Vero-76細(xì)胞接種于96孔板中，小鼠血清倍比稀釋后與VSV-SARS-CoV-2假病毒懸液(4.8 × 103感染滴度/mL)混勻室溫預(yù)孵育10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到Vero-76細(xì)胞中，37℃下孵育20 h。在Incucyte?中培養(yǎng)，通過(guò)4×物鏡并進(jìn)行明場(chǎng)全孔掃描和GFP熒光掃描。計(jì)算pVNT50（與無(wú)血清假病毒陽(yáng)性對(duì)照相比，可減少每孔50%GFP陽(yáng)性感染細(xì)胞數(shù)的最低血清稀釋度）來(lái)評(píng)價(jià)疫苗血清的病毒抑制能力。

Incucyte?實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像分析為以上的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)開展和數(shù)據(jù)分析提供了高效便捷的工具。2020年，Science副刊《Science Immunology》還曾專門發(fā)布獨(dú)家文章，對(duì)Incucyte?的相關(guān)應(yīng)用進(jìn)行聚焦和分析。

Nature 子刊，攻堅(jiān)實(shí)體瘤，CAR-T療法尋突破

2021年頂級(jí)醫(yī)學(xué)期刊nature medicine發(fā)布了CAR-T之父Carl June最新研究，也是首個(gè)CAR-T治療實(shí)體瘤臨床研究結(jié)果。CAR-T細(xì)胞療法治療實(shí)體瘤不再是停留在理論與展望階段，而是進(jìn)入了前列腺癌治療的Ⅰ期臨床研究，并且證實(shí)了抗TGF-β的CAR-T細(xì)胞療法治療轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌這一實(shí)體瘤是安全可行的。

我們看到了CAR-T細(xì)胞療法治療實(shí)體瘤取得的重大突破，但舉步維艱的過(guò)去同樣值得銘記和反思。實(shí)體瘤本身及其微環(huán)境的特殊性為細(xì)胞治療帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)，一方面，實(shí)體瘤細(xì)胞抗原的異質(zhì)性以及特異性腫瘤抗原的缺乏使CAR細(xì)胞難以對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)的靶向性識(shí)別和殺傷；另一方面，實(shí)體瘤特殊的腫瘤微環(huán)境，包括異常血管結(jié)構(gòu)和基質(zhì)成分組成的第一道物理屏障，以及TME 中多種免疫抑制細(xì)胞、抑制性免疫及代謝分子組成的二次屏障，使得細(xì)胞治療藥物難以浸潤(rùn)腫瘤組織。但隨著對(duì)腫瘤生物學(xué)和免疫學(xué)的進(jìn)一步研究，科學(xué)家開發(fā)了一些應(yīng)對(duì)策略克服這些障礙，使得細(xì)胞療法應(yīng)用于實(shí)體瘤成為可能。2023年3月23日14:00-15:30藥融圈聯(lián)合賽多利斯舉辦本次線上研討會(huì)，邀請(qǐng)2位行業(yè)專家，就細(xì)胞治療在實(shí)體瘤治療方面的新技術(shù)、新思想展開分享，歡迎觀看。