食道癌（EAC）是全球第六高致死率的癌癥。巴雷特食管癥（NDB）是已知的EAC前體病變，表現(xiàn)為食管的正常鱗狀粘膜被柱狀上皮覆蓋。其可經(jīng)歷低度異性增生（LGD）到高度異型增生（HGD），最終發(fā)展到食道癌。在過(guò)去的幾十年里，食道癌的發(fā)病率急劇增加。因此迫切的需要更好地了解疾病的病因，并識(shí)別新的預(yù)后和預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物，以提高患病的生存概率。在本文中，科學(xué)家們選取了17位不同的食道癌患者的樣本，進(jìn)行了綜合的數(shù)據(jù)分析。基于這些數(shù)據(jù)，共形成了3種生物型，共有119個(gè)表達(dá)譜，包括miRNA（51）、mRNA（51）和circRNA（17）。善用這種獨(dú)特的數(shù)據(jù)資源，有助于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物和疾病機(jī)制，進(jìn)行組織和液體活檢的比較，整合編碼和非編碼RNA模式，此外還可以作為其他基于RNA研究的驗(yàn)證方式。此外，在該數(shù)據(jù)集中還可以識(shí)別出結(jié)構(gòu)RNA的差異，包括蛋白質(zhì)編碼突變、融合基因和環(huán)狀RNA。該文由比利時(shí)根特大學(xué)Katleen De Preter團(tuán)隊(duì)于2022年3月在Nature 子刊scientific data 上發(fā)表。

實(shí)驗(yàn)方法：

● 患者樣本收集

該項(xiàng)目收集4名食道癌患者（EAC），5名高度異型增生患者(HGD)和8名非增生巴雷特食道癥患者(NDB）的共51份血液組織樣本。所用樣本均在治療前采集。組織樣本是在內(nèi)鏡檢查（NDB和HGD）或腫瘤手術(shù)切除（EAC）期間獲得的。從病變組織區(qū)收集至少一個(gè)組織樣本被送去進(jìn)行病理檢查。若收集到非目標(biāo)疾病或健康樣本則會(huì)使用RNAlater（Qiagen 76104 RNA保存液）進(jìn)行長(zhǎng)期保存。血液樣本使用6 ml EDTA管收集，然后用9 ml檸檬酸鈉（3.2%）真空血管進(jìn)行采血。1800g離心10 min制備血漿

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●?RNA提取

組織樣本：采用miRNeasy mini kit?（Qiagen 貨號(hào)217004）抽提總RNA。提取后的RNA由QUBIT進(jìn)行濃度測(cè)定，由安捷倫片段化分析儀進(jìn)行RNA 完整性質(zhì)控。其中高達(dá)70.6%的樣本的RNA完整性水平大于質(zhì)控?cái)?shù)字指標(biāo)7，表示質(zhì)量較好。

血漿樣本：采用miRNeasy Serum/Plasma Kit?（Qiagen 貨號(hào)217184）提取RNA，其中用來(lái)mRNA捕獲測(cè)序的樣本還進(jìn)行g(shù)DNA去除。

●? 測(cè)序

組織樣本：PolyA+ RNA 測(cè)序

采用TruSeq Stranded mRNA Library Prep kit?（Illumina）進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建，上樣量為100 ng。用安捷倫片段化分析儀進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)控，終文庫(kù)在NextSeq 500（Illumina）儀器上進(jìn)行paired-end測(cè)序。

血漿樣本：mRNA捕獲測(cè)序

使用TruSeq RNA Access Library Prep Kit?(Illumina,現(xiàn)已更名為TruSeq RNA Exome)進(jìn)行文庫(kù)制備，上樣量為8.5 μl?RNA洗脫液。使用安捷倫片段化分析儀進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)控。樣品在NextSeq 500（Illumina）儀器上進(jìn)行paired-end測(cè)序。對(duì)所有樣本進(jìn)行了兩次測(cè)序，以獲得適當(dāng)?shù)臏y(cè)序深度。

Small RNA 測(cè)序

使用NEBNext ?small RNA library prep kit進(jìn)行文庫(kù)制備，上樣量為100 ng （組織樣本）和 6 μl 總RNA（血漿樣本）。采用Pippin Prep系統(tǒng)，選擇含有成熟miRNAs（~147-157nt片段）文庫(kù)根據(jù)qPCR定量進(jìn)行歸一化并進(jìn)行匯總，并且用乙醇沉淀濃縮，用Qubit 2.0熒光儀定量。在NextSeq 500（Illumina）儀器上對(duì)組織和血漿樣本進(jìn)行單端測(cè)序。

結(jié)論：

1、基因表達(dá)和豐度分析

對(duì)組織和血漿中的mRNA、miRNA和環(huán)狀RNA進(jìn)行了同源基因表達(dá)和豐度分析。不同表達(dá)基因的數(shù)量見(jiàn)表1。預(yù)處理后的數(shù)據(jù)也被上傳到R2 Genomics Analysis and Visualization Platform 中(http://r2.amc.nl)，可對(duì)數(shù)據(jù)集的進(jìn)一步探索和可視化。在本研究中，我們?cè)贓AC、HGD和NDB患者的血漿中鑒定了幾種環(huán)狀RNA，它們的環(huán)狀結(jié)構(gòu)更能抵抗外切酶的RNA降解，因此這種類型的RNA作為循環(huán)生物標(biāo)記物具有很大的潛力。雖然我們關(guān)注使用小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行miRNA表達(dá)和豐度分析，但其他小RNA如tRNA（片段）和piRNA也可以使用我們的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

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2、相關(guān)miRNA和mRNA的表達(dá)

該數(shù)據(jù)集包含了匹配疾病和健康組織樣本的miRNA和mRNA數(shù)據(jù)。因此，我們?cè)跀?shù)據(jù)中可以研究miRNA和mRNA表達(dá)之間的關(guān)系。例如，已知Hedgehog（HH）信號(hào)通路在EAC和NDB60中發(fā)揮重要作用。在NDB中，hsa-miR-194表達(dá)的增加導(dǎo)致SUFU的丟失，從而導(dǎo)致Sonic Hegdgehog（SHH）基因的上調(diào)。在我們的NDB組織數(shù)據(jù)以及EAC和HGD組織樣本中，也觀察到與健康組織相比，hsa-miR-194和SHH的表達(dá)上調(diào)，以及SUFU的表達(dá)下調(diào)。這種獨(dú)特的數(shù)據(jù)集可對(duì)疾病和健康部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行匹配，以便進(jìn)一步探索相關(guān)通路，即通過(guò)使用miRNA和mRNA數(shù)據(jù)。

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3、突變分析

基于polyA+測(cè)序數(shù)據(jù)（組織）和mRNA捕獲測(cè)序數(shù)據(jù)（血漿），進(jìn)行突變分析。疾病特異性變異被嚴(yán)格篩選。隨后，這些變異與血漿中的變異進(jìn)行分析。在2例EAC患者、5例 HGD患者和4例NDB患者的血漿中，共發(fā)現(xiàn)了24個(gè)變異。每個(gè)患者發(fā)現(xiàn)1-7個(gè)變異，但在疾病組內(nèi)或組間沒(méi)有觀察到重疊。根據(jù)前列腺癌（COSM5564582）、宮頸癌或膽道癌（COSM5493837）或大腸癌（COSM5756079）的COSMIC 數(shù)據(jù)庫(kù)，樹(shù)狀變異是已知的腫瘤突變。這些結(jié)果證明了該數(shù)據(jù)集能夠在血漿RNA測(cè)序數(shù)據(jù)中識(shí)別可能的體細(xì)胞突變或疾病特異性RNA編輯事件。

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4、融合基因分析

EAC組織中融合基因分析的研究報(bào)道很少。在本文中，科學(xué)家們展示了檢測(cè)EAC、HGD和NDB組織和血漿樣本的融合基因的潛力。在組織樣本中，在所有樣本中都發(fā)現(xiàn)了潛在的融合基因。通過(guò)排除（在每個(gè)樣本的基礎(chǔ)上）在健康組織中也發(fā)現(xiàn)的融合基因，我們確定了疾病特異性的融合基因。對(duì)于所有的樣本，有2-14個(gè)融合基因保留（不包括潛在的假陽(yáng)性）。對(duì)于血漿樣本，在一個(gè)HGD患者樣本和兩個(gè)NDB患者樣本中識(shí)別出潛在的融合基因，其中有兩個(gè)重疊的融合基因（ID5_HGD和ID19_NDB）。疾病組織與血漿樣本之間沒(méi)有融合基因的重疊?？茖W(xué)家們?nèi)匀恍枰M(jìn)一步驗(yàn)證這些潛在相關(guān)的融合基因。

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本文好物推薦

在文章中科學(xué)家多次使用安捷倫片段化分析儀進(jìn)行樣本RNA完整性以及測(cè)序文庫(kù)質(zhì)控。該分析儀為平行毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，共有三個(gè)型號(hào)，5200,5300和5400.以5200型號(hào)為例?？稍?15 分鐘內(nèi)平行分離 12 個(gè)樣品。 該系統(tǒng)旨在消除實(shí)驗(yàn)室的瓶頸，讓您更加專注于結(jié)果。5200 片段分析儀系統(tǒng)可對(duì) gDNA、小 RNA、cfDNA、大片段 DNA 和總 RNA 等多種樣品進(jìn)行 DNA QC 和 RNA QC。這些系統(tǒng)可以分離樣品類型的多樣性使這些儀器成為個(gè)性化工作流程的理想工具，包括 NGS 文庫(kù) QC 和 CRISPR 工作流程。

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該儀器具有以下特性：

2?15 分鐘內(nèi)平行分離 12 個(gè)樣品

2?有 3 種不同的毛細(xì)管陣列長(zhǎng)度，可根據(jù)所需的速度或分辨率組合進(jìn)行選擇

2?無(wú)需進(jìn)行日常陣列處理以及采用室溫下穩(wěn)定的試劑，可最大限度縮短儀器準(zhǔn)備時(shí)間

2?結(jié)果清晰，300 bp 以下片段的分離分辨率高達(dá) 3 bp

2?可在運(yùn)行當(dāng)前樣品分離時(shí)進(jìn)行新樣品批次的加載和編程，從而提高實(shí)驗(yàn)效率

2?可以將隊(duì)列中的樣品向上或向下移動(dòng)，調(diào)整運(yùn)行順序

2?使用 RNA 質(zhì)量指標(biāo) (RQN) 以及基因組 DNA 質(zhì)量指標(biāo) (GQN) 以避免主觀質(zhì)量評(píng)估

2?試劑盒提供了涵蓋兩個(gè)數(shù)量級(jí)的較寬動(dòng)態(tài)范圍

2?通過(guò)可靠的彌散條帶分析準(zhǔn)確計(jì)算摩爾濃度

2?提供用于 GMP 環(huán)境的 IQ/OQ 服務(wù)

2?臺(tái)式電腦，通過(guò)惠普提供 3 年全面保修

Reference：Schoofs, K., Philippron, A., Avila Cobos, F.?et al.?Comprehensive RNA dataset of tissue and plasma from patients with esophageal cancer or precursor lesions.?Sci Data?9, 86 (2022)

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