研究團(tuán)隊(duì)通過基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)將含有疊氮基團(tuán)的非天然氨基酸定點(diǎn)修飾到Cas9蛋白上，通過直接或者間接與DBCO修飾的oligo-DNA發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，將供體DNA固定在Cas9蛋白上，將DNA精準(zhǔn)運(yùn)送至靶DNA區(qū)，增加在切割部位的供體DNA的濃度，在發(fā)生切割后，能夠迅速提供修復(fù)模板從而提升重組效率。

基因編輯技術(shù)近年來飛速發(fā)展，CRISPR/Cas9技術(shù)因其低成本簡單高效，極大的助力了基因治療時(shí)代的到來。利用CRISPR/Cas9對靶基因進(jìn)行切割，進(jìn)而通過供體DNA模板介導(dǎo)的同源重組修復(fù)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)基因編輯具有廣泛的應(yīng)用前景。然而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的同源重組的效率很低，大大限制該技術(shù)的應(yīng)用。如何提高同源重組頻率從而提高精準(zhǔn)基因編輯效率是CRISPR/Cas9在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用中亟待解決的重要問題之一。

基于這一科學(xué)問題，北京大學(xué)藥學(xué)院劉濤和北京大學(xué)第三醫(yī)院李默研究團(tuán)隊(duì)通過基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)將含有疊氮基團(tuán)的非天然氨基酸定點(diǎn)修飾到Cas9蛋白上，通過直接或者間接與DBCO修飾的oligo-DNA發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，將供體DNA固定在Cas9蛋白上，將DNA精準(zhǔn)運(yùn)送至靶DNA區(qū)，增加在切割部位的供體DNA的濃度，在發(fā)生切割后，能夠迅速提供修復(fù)模板從而提升重組效率。

非共價(jià)組裝方式更是提供了通用的蛋白核酸偶聯(lián)平臺，利用堿基互補(bǔ)配對實(shí)現(xiàn)無修飾的供體DNA的高效體外組裝導(dǎo)入細(xì)胞，在細(xì)胞水平展現(xiàn)出10倍的同源重組水平的提高。在小鼠胚胎細(xì)胞中通過顯微注射法導(dǎo)入核酸偶聯(lián)復(fù)合物，在不同劑量組均展現(xiàn)出高效的精準(zhǔn)基因敲入的效果，該技術(shù)為CRISPR/Cas9用于體外細(xì)胞精準(zhǔn)編輯，高效構(gòu)建動(dòng)物模型提供有力的技術(shù)方法。

以上成果于2020年4月在國際著名期刊Science Advances在線發(fā)表。劉濤研究員和李默研究員為本研究論文的通訊作者，劉濤團(tuán)隊(duì)博士研究生凌鑫宇和博士后高小芹以及李默團(tuán)隊(duì)博士后謝炳騰為論文的共同第一作者，北京大學(xué)天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室為第一責(zé)任通訊單位。

作者簡介：

劉濤，北京大學(xué)藥學(xué)院特聘研究員，博士生導(dǎo)師，分子與細(xì)胞藥理系主任，天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立PI。北京大學(xué)百人計(jì)劃，國家自然科學(xué)基金優(yōu)青獲得者。發(fā)表科研論文近30篇，代表論文包括J Am Chem Soc, Science Advances, PNAS, Cell Chem Biol, Angew Chem, J MedChem, ACS Chem Biol等。主要研究方向包括生物技術(shù)在生物藥物研發(fā)以及疾病機(jī)理解析中的應(yīng)用。發(fā)展了含有人造氨基酸的蛋白創(chuàng)新藥物，應(yīng)用在腫瘤及基因治療等多種領(lǐng)域，從而促進(jìn)了生物藥物的升級換代。獲得2018年中國藥學(xué)會以嶺生物醫(yī)藥獎(jiǎng)青年獎(jiǎng)以及2019年拜耳研究員獎(jiǎng)。

李默，北京大學(xué)第三醫(yī)院研究員、博士生導(dǎo)師；國家自然科學(xué)基金委優(yōu)青。主要從事DNA損傷與癌癥發(fā)生的分子機(jī)制。發(fā)表SCI論文40余篇，總引用次數(shù)1000余次，代表論文包括CancerCell、Cell Research、Nature Chemical Biology、Genes & Development、Science Advances、PNAS、Cancer Research等。