導(dǎo)讀

近日，華中科技大學(xué)鐘芳銳教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了拓展銅酶雜泛性催化吲哚氧化交叉偶聯(lián)反應(yīng)，合成了一系列光學(xué)純2,2-二取代吲哚啉-3-酮類(lèi)化合物。相關(guān)研究成果發(fā)表在Angew. Chem. Int. Ed., 2023, DOI：10.1002/anie.202219034。

正文

TOC圖（來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）酶是自然進(jìn)化形成的高效生物催化劑，一般適用于天然底物和相應(yīng)的生化反應(yīng)。隨著可持續(xù)合成化學(xué)的理念深入推進(jìn)，有機(jī)化學(xué)家們開(kāi)始探索天然酶的非天然反應(yīng)性，即“催化雜泛性”。近年來(lái)，這方面的研究已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展，尤其是鐵輔因子依賴(lài)的P450酶家族，結(jié)合定向進(jìn)化等生物技術(shù)，其催化活性已經(jīng)從天然的氧化反應(yīng)拓展至不對(duì)稱(chēng)卡賓/氮賓轉(zhuǎn)移等合成反應(yīng)（2018年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）。相比之下，銅氧化酶作為一大類(lèi)氧化還原酶家族，在不對(duì)稱(chēng)催化領(lǐng)域的應(yīng)用還十分少見(jiàn)?？紤]到小分子銅配合物在化學(xué)催化方面的多樣性功能，研究銅氧化酶的催化雜泛性以實(shí)現(xiàn)非天然不對(duì)稱(chēng)催化反應(yīng)是一個(gè)有意義的課題。近年來(lái)，氧化交叉偶聯(lián)反應(yīng)已經(jīng)成為綠色高效的合成工具，可以將兩個(gè)富電子親核試劑通過(guò)成鍵連接，避免了底物預(yù)功能化，具有顯著的原子經(jīng)濟(jì)性。不對(duì)稱(chēng)氧化交叉偶聯(lián)的難點(diǎn)在于同時(shí)控制氧化步驟的化學(xué)選擇性和偶聯(lián)步驟的對(duì)映選擇性（圖1a）。已知的文獻(xiàn)方法主要是基于化學(xué)氧化或光化學(xué)/電化學(xué)氧化與手性過(guò)渡金屬或有機(jī)催化劑的組合。氧化還原酶具有催化不對(duì)稱(chēng)氧化偶聯(lián)的潛力，如自然界中銅依賴(lài)漆酶催化的γ-萘酮同分異構(gòu)體(M)-ustilaginoidin A的不對(duì)稱(chēng)同源二聚反應(yīng)，具有專(zhuān)一的區(qū)域和對(duì)映選擇性（圖1b）。然而，非天然底物的酶促對(duì)映選擇性氧化偶聯(lián)反應(yīng)仍然很少。去年，Narayan小組利用工程化P450酶實(shí)現(xiàn)了酚類(lèi)分子生物催化交叉偶聯(lián)反應(yīng)，為軸手性聯(lián)芳基分子的合成提供了有效策略（圖1c）。

圖1.?生物催化氧化交叉偶聯(lián)反應(yīng)（來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）多銅氧化酶（MCOs）廣泛存在與自然界中，一般具有較低的底物特異性，可接納多種天然底物，其中主要類(lèi)別是酚類(lèi)化合物。MCOs通過(guò)單電子轉(zhuǎn)移機(jī)制催化酚的氧化反應(yīng)，生成易二聚或寡聚的活性苯氧自由基，難以控制氧化反應(yīng)下游的反應(yīng)過(guò)程。這種性質(zhì)導(dǎo)致漆酶催化的酚類(lèi)氧化偶聯(lián)反應(yīng)中常形成多種區(qū)域異構(gòu)體和立體異構(gòu)體的混合物，立體化學(xué)的調(diào)控往往依賴(lài)于額外的輔助蛋白。鐘芳銳團(tuán)隊(duì)致力于綠色仿生和生物催化領(lǐng)域的研究，利用化學(xué)原理驅(qū)動(dòng)酶催化選擇性合成的理念，發(fā)展了含有非天然光敏活性基團(tuán)的人工光敏金屬酶（J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 617）和“三重態(tài)光酶”（Nature, 2022, 611, 715）。基于銅催化氧化偶聯(lián)反應(yīng)的化學(xué)機(jī)制，發(fā)展了多銅氧化酶催化的多酚氧化環(huán)加成反應(yīng)（Green Chem, 2022, 24, 5598.）在之前的酶催化工作基礎(chǔ)上，構(gòu)思在酚類(lèi)底物中引入額外的氫鍵供體/受體，可能與酶的手性腔室形成有益的相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)映體誘導(dǎo)的可能性。由此發(fā)展了對(duì)多銅氧化酶CueO催化兩種不同類(lèi)型吲哚之間的不對(duì)稱(chēng)氧化偶聯(lián)反應(yīng)（圖1d）。這種方法具有良好的底物通用性、優(yōu)異的化學(xué)選擇性/對(duì)映選擇性和溫和的反應(yīng)條件。作者以3-羥基吲哚-2-羧酸1a和吲哚2a作為偶聯(lián)反應(yīng)物進(jìn)行條件優(yōu)化（表1）。由于后者帶有的缺電子酯基會(huì)顯著降低氧化反應(yīng)的活性，這有利于氧化步驟的化學(xué)選擇性，而偶聯(lián)產(chǎn)物3a含有的2,2-二取代吲哚-3-酮骨架也常見(jiàn)于一些生物活性分子。當(dāng)銅酶CueO進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，模型反應(yīng)在空氣中順利進(jìn)行，并且在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下（0.1 mol％ CueO，5.0當(dāng)量雙氧水，25℃，24小時(shí)）可以得到產(chǎn)物3a，收率為92％，對(duì)映選擇性為99％。其他多銅氧化酶，例如Cot A和MnxEFG，也能催化該反應(yīng)，但結(jié)果較差。令人高興的是，CueO細(xì)胞裂解液的結(jié)果與純化酶的結(jié)果幾乎相同，因此大大減少了繁瑣的蛋白質(zhì)純化過(guò)程，盡管銅氧化酶在天然生物系統(tǒng)中通常使用分子氧作為最終電子受體，當(dāng)前體系中過(guò)氧化氫的效果優(yōu)于分子氧和尿素過(guò)氧化氫，這可能是由于雙氧水與Cu2+離子的配位作用帶來(lái)了更合適的蛋白質(zhì)構(gòu)象。有機(jī)共溶劑的使用解決了底物的溶解度，但需要保持弱堿性以避免酸促進(jìn)背景偶聯(lián)反應(yīng)。例如，當(dāng)pH≤7.5時(shí)，酸催化背景反應(yīng)就會(huì)顯著提高，導(dǎo)致ee值降低。表1. 反應(yīng)條件優(yōu)化?（來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

該CueO催化不對(duì)稱(chēng)交叉偶聯(lián)具有較好的底物兼容性（圖2）。苯環(huán)上具有不同電子和立體性質(zhì)的取代基的吲哚酚、各種含鹵素、CF3或CN的吲哚親核試劑、富電子類(lèi)吡咯、1,3,5-三甲氧基苯和1,3-二甲氧基苯也同樣適用。除此之外，親核試劑的類(lèi)型還可以進(jìn)一步擴(kuò)展到sp3雜化碳親核試劑，如環(huán)狀和非環(huán)狀β-酮酸酯，相應(yīng)的產(chǎn)物均具有極好的立體選擇性。部分底物的放大實(shí)驗(yàn)（0.3-1.0 mmol）表明產(chǎn)物的產(chǎn)率和光學(xué)純度可以基本保持不變（產(chǎn)物3a、3d、3f和4c）。

圖2.?代表性底物的結(jié)果（圖片來(lái)源：基于原圖重新編輯）多銅氧化酶催化氧化酚類(lèi)底物一般通過(guò)自由基機(jī)理進(jìn)行。為了對(duì)該反應(yīng)的機(jī)理進(jìn)行更深入的研究，作者在模型反應(yīng)中添加了自由基清除劑如叔丁基羥基甲苯（BHT）。結(jié)果顯示，產(chǎn)品3a的生成幾乎被完全抑制，高分辨質(zhì)譜（HRMS）檢測(cè)到化合物4的生成（圖3a）。這一結(jié)果表明，反應(yīng)可能經(jīng)歷了酚氧自由基中間體的形成。另一方面，當(dāng)不加2a時(shí)，高分辨質(zhì)譜檢測(cè)到亞胺中間體5的生成。不過(guò)，該中間體非常不穩(wěn)定性，無(wú)法分離。相比之下，吲哚2a單獨(dú)無(wú)法被CueO氧化（圖 3b）。通過(guò)兩個(gè)底物的氧化還原電勢(shì)可以推測(cè)，CueO首先催化氧化吲哚酚1a形成中間體5，隨后與吲哚2a發(fā)生親核加成。由于相關(guān)文獻(xiàn)表明，加成步驟需要酸活化，作者推測(cè)CueO應(yīng)該起到了催化氧化和酸催化的雙重角色。CueO的蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB：3OD3）包含四個(gè)銅原子：一個(gè)類(lèi)型1銅（T1 Cu）負(fù)責(zé)底物氧化，一個(gè)三核簇負(fù)責(zé)氧還原。T1 Cu與兩個(gè)組氨酸、一個(gè)半胱氨酸和一個(gè)軸向配體甲硫氨酸形成三角配位模式，這不利于它提供額外的路易斯酸配位。而從底物譜的結(jié)果中可推測(cè)，平面型中間體5具有高度的對(duì)映面選擇性。由此，作者通過(guò)對(duì)CueO晶體結(jié)構(gòu)的活性位點(diǎn)進(jìn)行仔細(xì)分析，將中間體5作為底物進(jìn)行對(duì)接。模擬表明，中間體5緊密結(jié)合到結(jié)構(gòu)域2界面。利用LigPlot + v.2.2.7可視化分析表明（圖3c），中間體5位于一個(gè)由Ala153、Asp187、Lys188、Lys189、Asn240等殘基圍成的口袋。其中最顯著的弱相互作用來(lái)自于5的酯基與Asn240的酰胺N-H和Lys188的質(zhì)子化氨基間（圖3d），這些相互作用可能對(duì)交叉偶聯(lián)反應(yīng)的立體化學(xué)控制至關(guān)重要。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，這兩個(gè)殘基被突變成丙氨酸，兩個(gè)突變體CueO_K188A和Cueo_N240A的選擇性顯著變差（分別為86% ee和55% ee），產(chǎn)率也有所降低，這佐證了上述假設(shè)（圖3d）。

圖3 酶促反應(yīng)機(jī)理研究?（來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）文獻(xiàn)表明，2,2-二取代吲哚啉-3-酮類(lèi)分子可能具有顯著的生物活性。作者利用MTT法測(cè)定了部分產(chǎn)物對(duì)MCF-7腫瘤細(xì)胞系的毒性，得到了兩個(gè)顯著毒性的化合物3f和4a（濃度為50μM）（Figure 4A）。隨后的細(xì)化實(shí)驗(yàn)得到了IC50值分別為34.31 μM和37.2 μM，均高于臨床藥物伊立替康和5-氟尿嘧啶（Figure 4B）。

圖4?生物活性測(cè)試?（來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

總結(jié)

總之，鐘芳銳教授團(tuán)隊(duì)以銅酶CueO為生物催化劑，以H2O2為終端氧化劑建立了一種不同吲哚分子間的對(duì)映選擇性氧化交叉偶聯(lián)反應(yīng)，具有操作簡(jiǎn)便、高原子經(jīng)濟(jì)性、較好的底物普適性等特點(diǎn)，提供了一種光學(xué)純2,2-二取代吲哚酮的綠色合成方法，并篩選得到了兩個(gè)顯著抗癌活性分子。該工作拓展了多銅氧化酶的催化雜泛性，將啟發(fā)銅酶催化其它非天然氧化反應(yīng)的發(fā)展。

Huan Guo, Ningning Sun, Juan Guo, Tai-Ping Zhou, Langyu Tang, Wentao Zhang, Yaming Deng, Rong-Zhen Liao, Yuzhou Wu, Guojiao Wu, Fangrui Zhong*.??Angew. Chem. Int. Ed.?2023,doi:10.1002/anie.202219034