研究背景

胃癌是全球第五大最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因。盡管胃癌的發(fā)病率以每年約2%的速度下降，但由于人口老齡化的增加，預(yù)計(jì)未來(lái)幾年的病例數(shù)和死亡人數(shù)將增加。由于胃癌進(jìn)展的機(jī)制仍然難以理解，尋找新的有前景的分子標(biāo)志物可以為改善胃癌患者的臨床結(jié)果和預(yù)后提供新的治療方法。

2022年11月,南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科研究團(tuán)隊(duì)在期刊(IF:9.685)發(fā)表了題為“PSMA1 mediates tumor progression and poor prognosis of gastric carcinoma by deubiquitinating and stabilizing TAZ”的研究成果，以人癌和癌旁組織+人胃黏膜上皮細(xì)胞+小鼠腫瘤組織為研究對(duì)象，通過(guò)TMT標(biāo)記定量蛋白組學(xué)技術(shù)結(jié)合RT-qPCR、蛋白免疫印跡檢測(cè)等多個(gè)技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)，PSMA1可通過(guò)消除轉(zhuǎn)錄輔激活因子（TAZ）來(lái)促進(jìn)胃癌的進(jìn)展和增殖，這與PSMA1介導(dǎo)的去泛素化酶活性有關(guān)，可用作提示胃癌的潛在治療靶點(diǎn)。

研究思路

1.腫瘤中PSMA1表達(dá)上調(diào)

2.PSMA1通過(guò)介導(dǎo)TAZ蛋白的去泛素化促進(jìn)胃癌的發(fā)展

研究結(jié)果

1.?PSMA1的表達(dá)量高低與胃癌的進(jìn)展相關(guān)

為了探索PSMA1在人類胃癌研究中的臨床功能，研究人員使用來(lái)自癌癥基因組圖譜(TCGA)的RNA-seq來(lái)分析PSMA1在胃癌中的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，與鄰近的正常組織相比，腫瘤組織中PSMA1的表達(dá)水平上調(diào)（圖1A）。通過(guò)測(cè)量不同胃癌細(xì)胞系中的PSMA1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與GES-1細(xì)胞中的低PSMA1蛋白水平相比，胃癌細(xì)胞中的PSMA1蛋白水平更高（圖1B）。

免疫組織化學(xué)(IHC)染色顯示PSMA1表達(dá)在淺表性胃炎(SG)中相對(duì)較低，在腸化生(IM)中上調(diào)，在異型增生(DYS)中適度增加，在胃癌組織中顯著上調(diào)（圖1C、D）。胃癌患者中PSMA1表達(dá)的總生存期K-M圖顯示，PSMA1的高水平表達(dá)與胃癌患者的較差總生存期顯著相關(guān)（圖1E）。

圖1 |?PSMA1在胃癌組織中含量較高

2.?PSMA1與TAZ相互作用并使TAZ去泛素化

為了檢測(cè)可能作為PSMA1潛在相互作用靶點(diǎn)的特異性底物蛋白，研究人員進(jìn)行了TMT標(biāo)記蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)，以系統(tǒng)地檢測(cè)PSMA1敲除的B胃癌-823細(xì)胞與對(duì)照組相比蛋白譜的表達(dá)變化。蛋白組學(xué)結(jié)果顯示PSMA1 siRNA顯著降低了YAP和TAZ蛋白水平。為確定siPSMA1中TAZ蛋白水平的降低是否通過(guò)蛋白酶體降解發(fā)生，研究人員用蛋白酶體抑制劑MG132或自噬溶酶體抑制劑氯喹(CQ)處理siCtrl或siPSMA1胃癌細(xì)胞，結(jié)果顯示在缺乏PSMA1的情況下，蛋白酶體抑制劑處理顯著回調(diào)了TAZ蛋白水平，表明PSMA1穩(wěn)定了TAZ，并保護(hù)其免受蛋白酶體降解（圖3B）。

圖2 |?PSMA1維持 TAZ穩(wěn)定性

此外，研究人員用環(huán)己酰亞胺（CHX）處理胃癌細(xì)胞來(lái)抑制蛋白質(zhì)的合成，對(duì)兩種細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)表明，MG132可以抑制這一過(guò)程（圖3C）。并且PSMA1的敲除顯著增加了TAZ的多泛素化。綜上所述，這些結(jié)果表明PSMA1是作用于TAZ蛋白的一種有效去泛素化酶。

圖3 |?PSMA1通過(guò)去泛素化穩(wěn)定TAZ

3.PSMA1促進(jìn)胃癌細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲

為了研究PSMA1在胃癌進(jìn)展中的潛在功能，研究人員用siPSMA1和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒在AGS和B胃癌-823細(xì)胞中敲低和過(guò)表達(dá)PSMA1，結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，PSMA1敲低后胃癌細(xì)胞的集落數(shù)顯著減少（圖4A）。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PSMA1上調(diào)并促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的侵襲（圖4E、F）。細(xì)胞計(jì)數(shù)Kit-8(CCK-8)測(cè)定顯示PSMA1抑制降低了胃癌細(xì)胞的活力（圖4G）。PSMA1過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了胃癌細(xì)胞增殖和集落形成，分別由CCK-8和集落形成測(cè)定確定（圖4H，B）。這些結(jié)果表明PSMA1促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，代表PSMA1在胃癌發(fā)展中有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用。

圖4 |?PSMA1促進(jìn)胃癌細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲

4.PSMA1通過(guò)TAZ發(fā)揮致癌作用

為了說(shuō)明PSMA1在維持TAZ穩(wěn)定性方面的作用機(jī)制，研究人員利用內(nèi)源性蛋白質(zhì)進(jìn)行了相互免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示PSMA1可以與TAZ相互作用（圖5A）。此外，將外源Flag標(biāo)記的PSMA1和Myc標(biāo)記的TAZ質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)Flag標(biāo)記的PSMA1與Myc標(biāo)記的TAZ免疫共沉淀（圖5B）。此外，免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)PSMA1和TAZ顯著共定位（圖5D）。上述結(jié)果說(shuō)明了在胃癌細(xì)胞中PSMA1與TAZ相互作用的結(jié)論。為了研究TAZ是如何促進(jìn)胃癌進(jìn)展的，實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行了免疫共沉淀等一系列實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明TAZ依賴其賴氨酸214位點(diǎn)的去泛素化促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖5 |?PSMA1通過(guò)降低其泛素化來(lái)維持TAZ的穩(wěn)定性

5.在臨床胃癌樣本中，PSMA1與TAZ呈正相關(guān)，預(yù)示著較差的生存結(jié)果

圖6 |?PSMA1的致癌作用依賴于TAZ的穩(wěn)定性

臨床上，使用腫瘤微陣列（TMA）分析了94例胃癌患者腫瘤標(biāo)本和鄰近正常組織中PSMA1和TAZ的表達(dá)，以及相應(yīng)的臨床病理信息。PSMA1和TAZ在大多數(shù)腫瘤標(biāo)本中均顯示高表達(dá)（圖7A）。IHC評(píng)分顯示，PSMA1和TAZ蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于鄰近正常組織（圖7B）。

隨后，研究人員對(duì)收集的20對(duì)胃癌組織和淺表性胃炎組織，TAZ在腫瘤組織中顯示高表達(dá)。臨床病理分析顯示PSMA1的高表達(dá)與晚期TNM分期(P= 0.006)和陽(yáng)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P= 0.041)有關(guān)。研究人員進(jìn)一步探索了這種表達(dá)關(guān)聯(lián)對(duì)胃癌患者生存結(jié)果的預(yù)后影響。結(jié)果表明，PSMA1高表達(dá)患者的預(yù)后比低表達(dá)患者差，在TAZ蛋白中顯示了相同的結(jié)果（圖7C）。此外，PSMA1和TAZ水平之間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(圖7D)。

圖7 |?PSMA1上調(diào)TAZ以促進(jìn)體內(nèi)胃癌細(xì)胞增殖

6.PSMA1促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)

為了驗(yàn)證PSMA1對(duì)體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，研究人員向裸鼠皮下注射PSAM1缺陷的AGS細(xì)胞，并每3天測(cè)量腫瘤體積（圖7E），PSMA1缺陷組的腫瘤體積小于相應(yīng)的對(duì)照組。此外，對(duì)照組中的腫瘤重量比PSMA1缺陷組重(圖7F），IHC結(jié)果顯示敲除的PSMA1抑制Ki67、YAP和TAZ的表達(dá)（圖7G）。腫瘤組織的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，敲低的PSMA1抑制了C-Myc、PCNA、Ki67、YAP和TAZ的表達(dá)（圖7H），這與體外的結(jié)果一致。進(jìn)一步證明了PSMA1在體內(nèi)促進(jìn)胃癌的腫瘤生長(zhǎng)。

圖8 |?PSMA1對(duì)TAZ的調(diào)控機(jī)制方案

研究結(jié)論

本研究說(shuō)明上調(diào)的PSMA1穩(wěn)定了TAZ蛋白，促進(jìn)胃癌增殖（圖8）。PSMA1在胃癌中高表達(dá)，并與不良生存預(yù)后相關(guān)。PSMA1的上調(diào)促進(jìn)了增殖、集落形成、遷移和侵襲。進(jìn)一步的研究表明，PSMA1直接與TAZ相互作用，然后抑制TAZ的K27和K48連接的泛素化，以穩(wěn)定和激活TAZ。TAZ的上調(diào)逆轉(zhuǎn)了PSMA1在體內(nèi)外對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。PSMA1與TAZ蛋白相關(guān)，并抑制其在胃癌細(xì)胞中的多泛素化和蛋白酶體依賴性降解。這一發(fā)現(xiàn)表明PSMA1可作為胃癌的新型預(yù)后預(yù)測(cè)因子和治療靶點(diǎn)。

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這篇文章運(yùn)用TMT標(biāo)記蛋白組學(xué)平臺(tái)，系統(tǒng)的檢測(cè)了PSMA1敲除組的蛋白譜變化情況，找到關(guān)鍵的靶蛋白，從而進(jìn)一步研究PSMA1與TAZ蛋白之間的去泛素化作用，以及TAZ蛋白對(duì)于胃癌發(fā)展的作用機(jī)制，為后期胃癌臨床治療提供了新的思路。

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