寫在前面

????????今天推薦的是由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院在2020年8月23日發(fā)表于Cellular & Molecular Immunology（2020IF：11.530，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是JunCui教授，研究表明USP19通過自噬調(diào)控NLRP3功能抑制炎癥并促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。

研究背景

????????巨噬細(xì)胞極化為促炎M1型或抗炎M2型細(xì)胞對(duì)于建立宿主防御或修復(fù)組織至關(guān)重要。控制這一過程的確切分子機(jī)制仍然難以捉摸。

摘要部分

????????在這里，作者發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶19(USP19)作為抗炎開關(guān)，抑制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。USP19通過增加自噬通量和減少線粒體活性氧的產(chǎn)生來抑制NLRP3炎癥小體的激活。此外，USP19通過切割其多泛素鏈來抑制不依賴炎癥小體的NLRP3的蛋白酶體降解。USP19穩(wěn)定的NLRP3通過與IRF4直接結(jié)合促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化，從而阻止其p62介導(dǎo)的選擇性自噬降解。與這些觀察結(jié)果一致，與WT小鼠相比，Usp19-/-在注射明礬和殼多糖后，小鼠M2型巨噬細(xì)胞極化減少，白細(xì)胞介素1β分泌增加。因此，作者發(fā)現(xiàn)了一種新的機(jī)制，通過該機(jī)制USP19將NLRP3的促炎功能轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡坠δ?，并表明USP19是炎癥干預(yù)的潛在治療靶點(diǎn)。

研究?jī)?nèi)容

1.USP19缺乏促進(jìn)了明礬誘導(dǎo)的腹膜炎的促炎反應(yīng)? ? ?

????????為了研究USP19是否通過體內(nèi)自噬調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)，作者構(gòu)建了USP19 KO小鼠。據(jù)報(bào)道，自噬可誘導(dǎo)PAMP（病原體相關(guān)分子模式）或DAMP（損傷相關(guān)分子模式）的清除以減輕炎癥。為了揭示USP19在炎癥中的作用，作者使用明礬誘導(dǎo)的腹膜炎模型，以檢測(cè)IL-1β的產(chǎn)生。作者發(fā)現(xiàn)Usp19-/-與野生型（WT）小鼠相比，IL-1β顯著增加。為了確定Usp19小鼠中IL-1β產(chǎn)生的增加是否與巨噬細(xì)胞募集增加有關(guān)，作者量化了灌洗液中的巨噬細(xì)胞。出乎意料的是，明礬處理后Usp19-/-小鼠中巨噬細(xì)胞的總數(shù)減少了。作者推斷M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞之間的平衡可能在Usp19-/-小鼠中發(fā)生改變。事實(shí)上，作者發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞（F4/80+CD11b+MR+）的比例，而不是M1型巨噬細(xì)胞（F4/80+CD11b+CD86+f）的比例在明礬處理后的Usp19-/-小鼠中減少。

????????巨噬細(xì)胞極化與中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的募集密切相關(guān)。作者發(fā)現(xiàn)明礬誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞募集(CD11b+Ly6G+)在Usp19-/-中強(qiáng)烈增強(qiáng)。相反，Usp19小鼠對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞（CD11b+Siglec-F+）的招募嚴(yán)重受損。因此，這些結(jié)果表明，在明礬誘導(dǎo)的腹膜炎模型中，Usp19-/-缺陷將抗炎反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺追磻?yīng)。

研究結(jié)論：USP19缺乏促進(jìn)了明礬誘導(dǎo)的腹膜炎的促炎反應(yīng)。

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2.USP19的缺失通過促進(jìn)NLRP3炎性體激活增強(qiáng)了IL-1β的分泌

????????鑒于USP19在明礬誘導(dǎo)的腹膜炎模型中顯著抑制IL-1β的產(chǎn)生，作者認(rèn)為USP19可能調(diào)節(jié)炎癥小體的激活。作者從Usp19-/-小鼠中分離出不同的細(xì)胞類型，并檢查炎癥小體激活。Usp19的缺失顯著增加了BMDMs、BMDCs和MEFs對(duì)ATP、明礬和硅石刺激的IL-1β釋放。此外，相比WT小鼠，來自Usp19-/-小鼠的ATP處理的BMDM的上清液中裂解的caspase-1數(shù)量增加，表明Usp19缺乏確實(shí)增強(qiáng)了NLRP3炎性體激活。

????????在炎癥小體激活過程中，NLRP3通過PYD-PYD介導(dǎo)的相互作用觸發(fā)ASC斑點(diǎn)的形成。在USP19-KOTHP-1細(xì)胞中，LPS和ATP誘導(dǎo)的THP-1衍生巨噬細(xì)胞中的ASC斑點(diǎn)形成顯著增強(qiáng)以響應(yīng)炎性體激活?；罨腸aspase-1裂解gasderminD蛋白以驅(qū)動(dòng)細(xì)胞焦亡。作者發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體激活后，細(xì)胞死亡在Usp19-/-中更為突出。沒有觀察到由AIM2介導(dǎo)的炎癥小體激活而產(chǎn)生的差異。為了進(jìn)一步證實(shí)USP19抑制NLRP3炎癥小體激活，作者使用siRNA敲低WT和USP19-KOTHP-1衍生巨噬細(xì)胞中的內(nèi)源性Nlrp3，并發(fā)現(xiàn)NLRP3的缺失消除了USP19-KO細(xì)胞中IL-1β的上調(diào)。

研究結(jié)論：USP19缺乏特異性地增強(qiáng)了NLRP3炎性體激活和細(xì)胞死亡。

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3.USP19介導(dǎo)的自噬抑制ROS產(chǎn)生以抑制NLRP3炎癥小體激活

????????ROS是激活NLRP3炎性體的主要信號(hào)。為了確定USP19是否通過ROS產(chǎn)生影響NLRP3炎性體激活，作者探究了WT和Usp19巨噬細(xì)胞中的ROS積累。作者發(fā)現(xiàn)Usp19缺失在很大程度上增強(qiáng)了ROS的產(chǎn)生。此外，用線粒體靶向抗氧化劑Mito-TEMPO（一種線粒體ROS的特定清除劑）處理消除了Usp19-/-巨噬細(xì)胞中增加的IL-1β分泌。這些數(shù)據(jù)表明，USP19的缺失通過上調(diào)線粒體ROS的產(chǎn)生來增強(qiáng)NLRP3炎癥小體的激活。? ? ?

????????以前，作者表明USP19通過Beclin-1穩(wěn)定促進(jìn)自噬。為了研究USP19介導(dǎo)的自噬是否影響線粒體ROS的產(chǎn)生，作者敲除了Beclin-1，發(fā)現(xiàn)在沒有Beclin-1的情況下，Usp19缺失所誘發(fā)的ROS的上調(diào)被減弱了。Beclin-1的缺失消除了USP19對(duì)IL-1β分泌的影響。

研究結(jié)論：USP19/Beclin-1的缺失會(huì)損害自噬，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加并導(dǎo)致NLRP3炎癥小體激活。

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4.USP19的缺失損害了M2型巨噬細(xì)胞極化

????????嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和Th2型CD4淋巴細(xì)胞分泌的IL-4可促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。作者用IL-4處理WT和Usp19-/-BM細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Usp19-/-細(xì)胞中M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物Il-10、MR和Ym1的表達(dá)明顯減少，表明USP19在促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化方面有內(nèi)在的作用。腹膜中的殼多糖給藥可以特異性地引導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化。因此，作者給小鼠腹腔注射殼多糖，發(fā)現(xiàn)從Usp19-/-小鼠獲得的腹腔巨噬細(xì)胞，尤其是F4/80+CD11b+MR+巨噬細(xì)胞的比例降低。這一觀察結(jié)果一致，作者發(fā)現(xiàn)來自殼多糖處理的Usp19-/-小鼠的PEC中M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因Fizz1和MR的mRNA水平也降低。此外，作者發(fā)現(xiàn)Usp19-/-小鼠中殼多糖引發(fā)的嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量也減少了。

研究結(jié)論：USP19對(duì)于響應(yīng)殼多糖給藥促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化至關(guān)重要。

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5.USP19抑制IRF4免受p62介導(dǎo)的選擇性自噬降解? ? ?

????????作者接下來試圖確定USP19是否通過作用于M2型巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子來促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。作者進(jìn)行了放線菌酮（CHX）追逐試驗(yàn)并發(fā)現(xiàn)Usp19缺乏導(dǎo)致內(nèi)源性IRF4的顯著降解，而不是KLF4或STAT6。值得注意的是，與WT組相比，Usp19缺陷細(xì)胞中IRF4的降解速度加快。作者接下來觀察到USP19的過表達(dá)增加了具有穩(wěn)定NLRP3表達(dá)的293T細(xì)胞中的IRF4蛋白水平。鑒于USP19過表達(dá)沒有改變IRF4 mRNA，增加的IRF4豐度發(fā)生在蛋白質(zhì)水平。為了確定IRF4的哪個(gè)結(jié)構(gòu)域被USP19穩(wěn)定，作者用Myc-USP19共轉(zhuǎn)染HEK293T-NLRP3細(xì)胞。免疫印跡分析顯示USP19穩(wěn)定了IRF4的C和N端結(jié)構(gòu)域。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)USP19介導(dǎo)的IRF4穩(wěn)定被自噬抑制劑完全抑制。這些結(jié)果表明USP19通過阻斷自溶酶體或蛋白酶體途徑來穩(wěn)定IRF4。

????????此外，作者將BM細(xì)胞置于自噬誘導(dǎo)條件下，包括饑餓和雷帕霉素處理，并發(fā)現(xiàn)IRF4蛋白水平降低。相比之下，自噬抑制劑阻止IRF4降解。作者檢查了IRF4與不同受體的相互作用，發(fā)現(xiàn)IRF4與p62特異性相互作用。此外，作者發(fā)現(xiàn)IRF4在NH4Cl存在下與LC3B共定位。這些數(shù)據(jù)表明IRF4通過受體p62被招募到自噬體。接下來，作者剖析了USP19在IRF4穩(wěn)定中的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)USP19過表達(dá)損害了IRF4-p62關(guān)聯(lián)。同樣，在BM細(xì)胞中，作者還檢測(cè)到p62和IRF4的內(nèi)源性關(guān)聯(lián)，并發(fā)現(xiàn)Usp19缺陷顯著增強(qiáng)了p62和IRF4之間的關(guān)聯(lián)。作者還發(fā)現(xiàn)USP19不能進(jìn)一步穩(wěn)定p62缺陷細(xì)胞中的IRF4蛋白。此外，作者在Usp19-/-BM細(xì)胞中重新表達(dá)小鼠Irf4并觀察到小鼠Irf4的重新表達(dá)恢復(fù)了Usp19-/-BM細(xì)胞中IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞極化。

研究結(jié)論：USP19通過抑制IRF4免受p62介導(dǎo)的選擇性自噬降解來促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。

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6.USP19通過NLRP3穩(wěn)定IRF4

????????為了研究USP19如何防止p62介導(dǎo)的IRF4降解，作者探究了USP19是否通過直接相互作用影響IRF4穩(wěn)定性。然而，作者沒有檢測(cè)到USP19和IRF4之間的相互作用，這意味著USP19穩(wěn)定IRF4的功能是間接的。NLRP3通過與患者中的IRF4作用而導(dǎo)致哮喘以及M2型巨噬細(xì)胞極化障礙是哮喘的主要原因。因此，作者檢查了NLRP3在M2型巨噬細(xì)胞極化中的功能，并觀察到NLRP3缺失降低了M2型巨噬細(xì)胞的比例，并減少了體內(nèi)響應(yīng)殼多糖的中性粒細(xì)胞的募集。作者進(jìn)一步證實(shí)，在BM細(xì)胞中的IL-4刺激后，IRF4與NLRP3相關(guān)，并且IRF4的N末端對(duì)于IRF4-NLRP3關(guān)聯(lián)至關(guān)重要。有趣的是，Usp19缺失通過影響它們的降解率降低了NLRP3和IRF4的蛋白質(zhì)水平。此外，作者發(fā)現(xiàn)敲低NLRP3可以顯著降低USP19誘導(dǎo)的IRF4積累。

研究結(jié)論：NLRP3可能在USP19介導(dǎo)的IRF4穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。

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7.NLRP3阻止p62介導(dǎo)的IRF4自噬降解? ? ?

????????鑒于NLRP3和IRF4的蛋白質(zhì)水平在WT和Usp19-/-細(xì)胞中相似。作者假設(shè)NLRP3與IRF4積累有關(guān)。作者收集殼多糖處理的WT和Nlrp3-/-PECs并發(fā)現(xiàn)Nlrp3缺失消除了IRF4積累。另一方面異位NLRP3表達(dá)強(qiáng)烈增加IRF4積累。此外，作者進(jìn)行了CHX追逐測(cè)定并證明Nlrp3缺乏加速了內(nèi)源性IRF4降解的速度。作者接下來發(fā)現(xiàn)自溶酶體抑制劑3-MA、CQ和NH4Cl單獨(dú)穩(wěn)定IRF4，而添加NLRP3并沒有進(jìn)一步穩(wěn)定IRF4。作者還證明NLRP3不能進(jìn)一步增加BECN1-KO細(xì)胞中的IRF4蛋白水平。由于IRF4僅與p62相互作用，作者檢查了IRF4、NLRP3和p62之間的相互作用。數(shù)據(jù)顯示外源NLRP3消除了IRF4-p62相互作用。這一觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Nlrp3缺乏顯著增加了響應(yīng)IL-4的IRF4-p62關(guān)聯(lián)。最后，作者表明NLRP3不能進(jìn)一步增加SQSTM1-KO HEK293T細(xì)胞中的IRF4蛋白水平。

研究結(jié)論：NLRP3通過阻斷IRF4-p62相互作用來抑制IRF4降解。

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8.USP19與NLRP3相互作用并使其穩(wěn)定

????????為了進(jìn)一步確定USP19穩(wěn)定NLRP3蛋白的分子機(jī)制，作者檢查了它們的直接相互作用。在BM細(xì)胞中，內(nèi)源性USP19和NLRP3直接相關(guān)，但它們的相互作用因炎性體激活而降低。這些數(shù)據(jù)意味著NLRP3摻入M1型巨噬細(xì)胞中的炎性體會(huì)減少其與USP19的結(jié)合，因此作者假設(shè)未摻入炎性體的NLRP3可能結(jié)合USP19并促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。事實(shí)上，NLRP3 R260W突變體，一種活性形式的NLRP3，在沒有刺激的情況下直接觸發(fā)IL-1β分泌，與WT NLRP3相比，結(jié)合USP19的能力降低。因此，USP19不能穩(wěn)定NLRP3 R260W突變體。作者還發(fā)現(xiàn)在蛋白酶體抑制劑MG132、lactacystin和卡非佐米存在的情況下，USP19介導(dǎo)的NLRP3積累被消除，但自溶酶體抑制劑3-MA或CQ沒有這種效果。此外，作者進(jìn)行了CHX追逐測(cè)定并證明Usp19缺陷降低了內(nèi)源性NLRP3的穩(wěn)定性，但這種表型可以通過MG132處理減弱。

研究結(jié)論：USP19直接結(jié)合未摻入炎性體的NLRP3并抑制其蛋白酶體降解。

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9.USP19在賴氨酸689處切割NLRP3的多聚泛素鏈? ? ?

????????作者發(fā)現(xiàn)催化失活的USP19 C506S/H1157A突變體未能穩(wěn)定NLRP3蛋白，表明NLRP3通過去泛素化而穩(wěn)定。作者證實(shí)USP19缺乏顯著增加了響應(yīng)IL-4的NLRP3泛素化。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，USP19特異性地剪切了NLRP3的K6連接的多聚泛素鏈，并且USP19的催化失活突變體未能剪切NLRP3的多聚泛素鏈。作者接下來試圖確定NLRP3上的哪些賴氨酸(K)殘基與這種修飾相關(guān)。使用計(jì)算機(jī)輔助算法，作者確定了NLRP3中的六個(gè)關(guān)鍵泛素化位點(diǎn)，并用精氨酸(R)替換它們以創(chuàng)建其對(duì)應(yīng)的突變體。作者發(fā)現(xiàn)NLRP3中的K689是USP19介導(dǎo)的NLRP3積累所必需的。進(jìn)一步的分析證實(shí)USP19不能進(jìn)一步去泛素化NLRP3 K689R突變體。

研究結(jié)論：USP19在K689處剪切NLRP3的多泛素鏈并抑制NLRP3的蛋白酶體降解。

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結(jié)論與討論

????????總之，作者證明了USP19如何塑造NLRP3在炎癥發(fā)生和消退中的功能。在該模型中，一方面，USP19促進(jìn)自噬，從而清除ROS并下調(diào)NLRP3炎癥小體激活。另一方面，USP19通過去除K689上的多泛素鏈來穩(wěn)定炎性體的NLRP3，并促進(jìn)NLRP3與IRF4的相互作用，從而防止IRF4依賴p62的選擇性自噬降解。由于巨噬細(xì)胞極化功能障礙與許多人類疾病有關(guān)，未來針對(duì)USP19的發(fā)展可能對(duì)炎癥相關(guān)疾病具有治療潛力。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41423-020-00567-7