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「青蓮聚焦」強強聯(lián)合—組學技術+WGCNA分析在阿爾茨海默病 (AD）中的應用

2022-03-18 14:53 作者:青蓮百奧 0人讀過 | 我要投稿

癡呆癥影響著世界9%的人口，造成巨大的社會和經濟負擔。其中阿爾茨海默病(AD) 是最常見的癡呆類型疾?。ㄕ及V呆癥病因的50%-75%），是老年人群中最常見的神經變性病，隨著人口老齡化的加劇，其發(fā)病率逐年升高。其病理特征是由Tau蛋白（微管系統(tǒng)是神經細胞骨架成分，可參與多種細胞功能，Tau蛋白是含量高的微管相關蛋白）過度磷酸化形成的神經原纖維纏結與由 Aβ 沉積物組成的老年斑。

WGCNA（weighted gene co-expression network analysis，權重基因共表達網絡分析）是一種分析多個樣本基因表達模式的分析方法，可將表達模式相似的基因進行聚類，并分析模塊與特定性狀或表型之間的關聯(lián)關系，因此在疾病以及其他性狀與基因關聯(lián)分析等方面的研究中被廣泛應用。簡單來說利用WGCNA分析可以構建共表達網絡關系，將所有的具有相同表達情況的基因群體進行聚類，根據相似性將網絡切分為模塊，再將模塊與表型相關性進行聯(lián)系分析模塊的功能，了解模塊的整體情況之后我們可以鑒定模塊中的hub基因。

WGCNA分析流程

常規(guī)組學的篩選是通過篩選差異表達蛋白/基因/代謝物，結合研究方向而后通過生信分析的輔助，通過KEGG通路將轉錄組/蛋白質組/代謝組數(shù)據聯(lián)合起來，找到同一生物進程（KEGG Pathway）中發(fā)生顯著性變化的基因、蛋白質和代謝物，快速鎖定關鍵基因、蛋白或代謝物。再結合富集分析、KEGG通路標色等實現(xiàn)關聯(lián)結果的可視化。對比組學方法來看WGCNA分析通過構建共表達網絡確定模塊功能而后分析其中hub基因，在網絡中，被調控線連接的基因，其表達模式是相似的，我們可以認為它們有相似的功能。所以，在這個網絡中，如果線條一端的基因功能是已知的，那么就可以預測線條另一端功能未知的基因也具有相似的功能，這就為我們下一步功能驗證未知基因打開了一扇窗戶。兩種方法的目的相似角度不同，因此利用WGCNA分析與組學方法結合是很好的研究方法，可以相輔相成互為補充。接下來分享2篇案例

案例一

Deep Multilayer Brain Proteomics Identifies Molecular Networks in Alzheimer's Disease Progression.

期刊：Neuron（IF= 14.415）研究目的：對人類腦組織進行蛋白組學和磷酸化組學分析，整合多個組學數(shù)據集共同揭示了AD進展過程中新的蛋白和分子網絡。

實驗分組：

（1）LPCs（對照組）：老年斑和神經原纖維纏結程度較低；

（2）HPCs（對照組）：Aβ病理學高但無明顯認知缺陷；

（3）MCI（實驗組）：Aβ病理程度輕微其具有輕度認知損傷；

（4）AD（實驗組）：晚期AD伴老年斑和神經原纖維纏結程度較高；

（5）PSP（實驗組）：另一種神經退行性Tau病—進行性核上性麻痹。

選取樣本：腦組織與腦脊液樣本

采用方法：蛋白質組學、磷酸化蛋白質組學、WGCNA分析

實驗設計：

研究內容：

首先通過蛋白組學分析，一共鑒定到了14513個蛋白。蛋白組學分析中，共獲得173個差異蛋白，Aβ蛋白的表達水平與病理結果基本一致。聚類分析、主成分分析和相關性分析進一步支持了數(shù)據的可靠性。而后研究人員分別進行了WCGNA分析對差異蛋白進行聚類，并利用互作網絡分析以及通路分析來解析蛋白組的表達規(guī)律以及分子網絡變化特征，從分析中確定了三個完整的蛋白質組簇（稱為 WPC）。WPC1 ( n = 50) 顯示 HPC 和 MCI 在早期時期 AD 相關物質的持續(xù)積累，包括 Aβ、TREM2 和 CLU。以及這些蛋白質在富含淀粉樣蛋白級聯(lián)、WNT 信號傳導、TGFβ/BMP 信號傳導、G 蛋白信號傳導、整合素途徑、先天免疫、適應性免疫、細胞骨架和細胞外基質、膜轉運、脂質代謝、蛋白質折疊和降解以及突觸的 12 種途徑功能。WPC2 ( n = 88) 在 HPC 和 MCI 階段相對穩(wěn)定，但在進展到 AD 時顯示顯著增加，包括 MAPT (tau) 和補體成分。WPC2 概括了 WPC1 中所有豐富的通路，并包含三個額外的細胞因子信號通路、補體和凝血以及鐵穩(wěn)態(tài)。相比之下，WPC3 ( n = 27) 的 HPC 和 MCI 沒有明顯變化，隨后在 AD 組中顯著下降（可能是神經保護作用的相關蛋白），確定了另外兩條神經營養(yǎng)因子信號通路和線粒體功能通路。

之后，作者將每個 WPC 模式中的 DE 蛋白與蛋白質－蛋白質相互作用網絡整合以定義 11 個功能模塊，提供蛋白質－蛋白質相互作用的證據以支持這些富集途徑。在 AD 中的 173 種 DE 蛋白中，163 種（94%）蛋白在 PSP 大腦中沒有顯示出顯著變化，表現(xiàn)出高度的 AD 特異性。結合蛋白組學與WCGNA分析所鑒定到的大多數(shù)的差異蛋白質是新的，作者通過WB在 AD 樣本中驗證了 11 種蛋白，同時還增加大規(guī)模驗證分析，其中 58 種（69%）在 AD 中表現(xiàn)出一致的變化。大規(guī)模的驗證分析證明了蛋白質組學研究的可重復性。作者為了進一步檢查 AD 腦組織中的這些差異蛋白質是否可作為腦脊液 (CSF) 中的潛在生物標志物被檢測到，對 CSF 樣本進行了蛋白質組學分析（n = 13，5個對照+ 8個 AD 病例）量化了 5940 種蛋白質。檢測了 AD 腦組織中 58 種蛋白質變化中的 49 種蛋白質，其中 8 種蛋白質在腦脊液樣本中持續(xù)變化。其中，4 種蛋白質（GPNMB、SMOC1、NPTX2 和 VGF）已在 AD CSF的相關研究中報道過，其他 4 種蛋白質（SLC39A12、SLC5A3、SLIT2 和 STEAP3）可作為新的候選生物標志物。

為了了解AD中磷酸化蛋白質組衍生的激酶活性，作者通過磷酸化蛋白組分析一共鑒定了7083個蛋白上的34173個磷酸位點，其中有來自398個蛋白的873個磷酸化肽段差異表達，微管相關蛋白Tau在AD組中的磷酸修飾水平最，聚類分析結果也顯示出AD組的磷酸化蛋白質組變化最為劇烈。在聚類分析中，AD 組與其他組的距離大，表明 AD 具有最顯著的磷酸化蛋白質組變化。與整個蛋白質組分析類似，逐步計算流程用于鑒定 873 種 DE 磷酸肽，分成四個主要的磷酸肽簇，PPC1-4 模式表明蛋白質磷酸化是高度動態(tài)的，并且在 AD 的不同階段積極重塑。同時檢測了每種 PPC 模式中富集的磷酸化蛋白途徑，揭示了 AD 中剪接功能障礙和鈣假設的兩種新途徑。特別的是，磷酸化蛋白質組和蛋白質組之間只有 11 個蛋白質重疊，表明磷酸蛋白質組分析代表了一個新的分子調控層面，可以對蛋白質組的全景信息進行補充。

接下來，研究人員利用 IKAP機器學習算法推斷出186種激酶的活性，其中28種主要在AD組中發(fā)生變化。基本上涵蓋了所有已知的Tau激酶。最終，研究人員通過蛋白質組和磷酸蛋白質組分析了這28個激酶及其相關家族成員的表達水平。盡管絕大多數(shù)激酶在蛋白質水平上沒有變化，但MAPK級聯(lián)通路中表現(xiàn)出明顯的磷酸化修飾水平上調，包括：MAP4K、MAP3K、MAP2K和MAPK。MAPK信號負調節(jié)因子DUSP6在AD組中顯著降低。這些結果驗證了前人的研究結論：MAP激酶信號的激活與AD的發(fā)病機制有關。

接下來作者為了探索 Aβ 積累誘導的分子事件，將確定到的 28 個 Aβ 相關差異蛋白在小鼠中進行檢測觀察，看會不會也有相同表現(xiàn)。8種Aβ相關的差異蛋白中有23種在小鼠中被鑒定到，15種持續(xù)增加，其中4種與RNA上調相關，這表明5xFAD小鼠中大多數(shù)Aβ相關蛋白受轉錄后機制調控。同時將小鼠差異蛋白質與人類組織差異蛋白質進行對比，結果表明：小鼠表現(xiàn)出與AD晚期相似的蛋白質組特征，但表現(xiàn)出自噬和干擾素反應的激活，并且缺乏人類特有的有害事件，例如神經營養(yǎng)因子和突觸蛋白的下調。解釋了小鼠模型和臨床試驗之間的轉化差距。

最后研究人員整合了7個AD數(shù)據集（MCI蛋白質組、AD蛋白質組、磷酸蛋白質組、聚集蛋白質組；全基因組關聯(lián)分析；轉錄組；蛋白相作組），使用順序統(tǒng)計和基因集富集分析（GSEA）對基因/蛋白質與途徑進行等級排序。蛋白排序中，APP、APOE和MAPT為前3位，與目前對AD發(fā)病機制的理解一致。GSEA對信號通路進行了優(yōu)先排序，確定了16條通路，共分為4大類：淀粉樣蛋白和Tau通路、炎癥、生長發(fā)育以及代謝和膜轉運。此外，亞細胞定位分析表明，在AD中，分泌子體和細胞表面子體受到特別的干擾，可能對細胞通訊產生強烈的影響。同時，免疫組化實驗表明，與正常對照病例相比，MDK、NTN1、SMOC1 和 ICAM1 在 AD 的某些斑塊結構中明顯積累。進一步使用親和結合試驗探討了這些蛋白質是否與 Aβ 發(fā)生物理相互作用。發(fā)現(xiàn)，MDK 和 NTN1 直接與 Aβ 40柱結合，但不與對照柱結合，而其他兩種蛋白質（SMOC1 和 ICAM1）在該試驗中未顯示與 Aβ 40結合。表明MDK 和 NTN1 顯示直接 Aβ 結合，暗示它們可能在 AD 腦中一起發(fā)揮作用。

案例二

Identification of Conserved Proteomic Networks in Neurodegenerative Dementia.期刊：Cell Reports（IF= 8.109）研究目的：對人類腦組織進行蛋白組學和磷酸化組學分析，整合多個組學數(shù)據集共同揭示了AD進展過程中新的蛋白和分子網絡。

實驗分組：

（1）正常組：老年斑和神經原纖維纏結程度較低；

（2）無癥狀AD（AsymAD）組：Aβ病理學高但在死亡時間附近沒有明顯的認知障礙；

（3）AD組：晚期AD伴老年斑和神經原纖維纏結程度較高；

（4）PSP組：另一種神經退行性Tau病—進行性核上性麻痹。

選取樣本：腦組織與腦脊液樣本

采用方法：蛋白質組學、轉錄組學、WGCNA分析

實驗設計：

研究內容：首先，研究人員運用蛋白質組學技術和轉錄組技術對超過1000個癡呆病理樣本包括AD、無癥狀AD、PSP和對照進行檢測，共鑒定到65,000個肽段，對應每個樣本約5000個蛋白。為了發(fā)現(xiàn)與腦庫和皮層區(qū)域的共表達變化情況，作者對來自 BLSA、ACT、MSBB、Banner 和 Mayo 腦庫的隊列進行了WGCNA分析。確定了代表所有四種主要腦細胞類型的 10 個共有模塊（標記為 C1-C10）：神經元（C1 和 C2 模塊）、小膠質細胞/內皮細胞（C10 模塊）、星形膠質細胞（C8 模塊）和少突膠質細胞（C5 模塊）。在所有五個數(shù)據集中確定了兩個與 AD 診斷顯著相關的模塊（C8 和 C10）（p < 0.05），一個模塊（C1）在四個數(shù)據集中與診斷顯著相關，另外三個模塊（C2、C3、和 C4）在五個數(shù)據集中的至少三個中與診斷顯著相關（p < 0.05），總共六個 AD 相關模塊。與對照組相比，AD 中四個共有模塊（C3、C4、C8 和 C10）上調，兩個共有模塊（C1 和 C2）在 AD 中下調。

進一步利用無癥狀AD（認知能力不受影響但有顯著的神經原纖維纏結和斑塊病理特征）作為疾病發(fā)展早期樣本，研究者發(fā)現(xiàn)一個神經元模塊（C1）被下調，兩個神經膠質模塊（C8和C10）被上調。為了尋找與疾病發(fā)展相關的致病因素，研究者針對代表了疾病發(fā)展早期的無癥狀AD的蛋白表達模塊進行研究。C1模塊代表神經元中高表達的基因，與突觸進程相關，富集突觸前/后囊泡中樞蛋白如HOMER1、DLG4和SYT1；C8代表星形膠質細胞中高表達的基因，富含免疫應答和細胞粘附蛋白；C10模塊富集小膠質細胞和內皮標志物，其中一個蛋白ANXA1參與到小膠質細胞的抗炎和神經保護作用以及Aβ的清除過程中。綜上，這些分析表明神經元/突觸基因下調以及星形膠質和小膠質上調是AD早期發(fā)展的重要特征，并且與之前的研究相一致。

針對代表了疾病發(fā)展早期的無癥狀AD的蛋白表達模塊進行研究之后，作者接下來評估了在代表 AD 的后期癥狀階段的病例中發(fā)生的蛋白質組學變化，確定了 AD 中的一個下調 (C2) 和兩個上調 (C3 和 C4) 模塊。C2模塊由線粒體電子傳輸鏈亞基和ATPase亞基組成；C3模塊富含與MAPK信號傳導有關的基因；C4模塊富含參與mRNA剪接的基因。同時，這些模塊與其他研究隊列觀察到了類似的趨勢。

得到上述結果后，作者認為重點在于針對癡呆疾病轉錄組數(shù)據和蛋白組數(shù)據的整合分析，這對于了解疾病的進程非常重要，因此研究者利用多個神經退行性疾病的隊列樣本進行分析，結果顯示幾乎超過一半的蛋白組數(shù)據變化能反應基因的表達，并且相等比例的調控來自轉錄后，進一步強調了蛋白組研究以及兩個水平數(shù)據互補整合的重要性。

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