動物的選擇

NCG免疫缺陷小鼠為人源化小鼠模型，此品系缺失成熟的T細胞、B細胞和NK細胞，可以用來移植人類造血干細胞、腫瘤細胞。選用NOD-Prkdcem26Cd52（上標）Il2rgem26Cd22（上標）/Nju(NCG)免疫缺陷小鼠。

造模方法

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表達熒光素酶慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

以慢病毒質(zhì)粒lentiCRISPRv2作為骨架載體，lentiCRISPRv2質(zhì)粒原表達框架為cas9及共表達的嘌呤霉素，將表達cas9的序列通過分子生物學手段替換成表達熒光素酶的基因序列，即可得到熒光素酶與嘌呤霉素共表達的病毒包裝質(zhì)粒。對lentiCRISPRv2進行XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切去除cas9表達框，酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖膠跑膠回收10000bp處條帶，利用Addgene設計引物lentiCRISPRv2-luc+-F(5’-GAACACAGGACCGGTTCTAGAGCGCTGCCACCATGGAAGACGCCAAAAAC-3’)和引物lentiCRISPRv2-luc+-R(5’-GAAGTTTGTTGCGCCGGATCCACACGGCGATCTTTCCGC-3’)，以PLG-3 basic為模板，采用 PhantaMaxmastermixPCR擴增熒光素酶基因片段。ONEstepCloneKit(Vazyme)將lentiCRISPRv2膠回收產(chǎn)物和 PCR產(chǎn)物進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli DH5α大腸桿菌感受態(tài)，帶氨芐青霉素的Luria-Bertani(LB)平板上篩選轉(zhuǎn)化子，用引物lentiCRISPRv2-luc+-F 和lentiCRISPRv2luc+-R對轉(zhuǎn)化子進一步篩選，并通過測序進一步驗證，通過Snapgene進行序列比對，陽性克隆命名為lentiCRISPRv2-luc+。

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慢病毒的包被、濃縮

HEK293T細胞常規(guī)培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃恒溫，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇生長狀態(tài)良好的HEK293T細胞，于10cm培養(yǎng)皿接種約4×1000000胞，12~16h后達到70%~80%融合率。在一個無菌的5mL試管中，加入無血清Opti-DMEM培養(yǎng)基1.5mL，依次加入12.5μg的lentiCRISPRv2-luc+、10μgVSVG和7.5μgΔ8.91 3種質(zhì)粒，輕輕混勻。在另一個無菌的5mL試管中，將60μL聚乙烯亞胺(PEI)(1ng/μL)稀釋于1.5mL無血清Opti-DMEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫放置5min。將稀釋好的PEI緩慢加入混勻的質(zhì)粒中，混勻，室溫孵育20min，形成DNA-脂質(zhì)體復合物，逐滴加入培養(yǎng)皿中，8h后換成完全培養(yǎng)基。收集轉(zhuǎn)染后48h和72h的病清，4℃，4000r/min離心30min去除細胞碎片，并用0.45μm濾膜過濾，進一步去除細胞碎片；4℃條下，25000r/min超速離心2h，保留沉淀，利用RPMI1640培養(yǎng)基溶解沉淀即為濃縮病毒，將病毒分裝，立即使用或凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

3

慢病毒滴度的測定

實時熒光定量PCR(RealtimeQuantitativePCR，qPCR)法測定慢病毒的滴度，以lenti-luc+大抽質(zhì)粒為標準品，測定標準曲線:利用阿佛加德羅定律推論，將lentiCRISPRv2-luc+逐級稀釋成1010，109，108，107，106，105，104，103，100，10，0個拷貝等梯度濃度，每個梯度重復3次，設計引物:WPRE-F(5’-GGCACTGACAATTCCGTGGT-3’)和 WPRE-R(5’-AGGGACGTAGCAGAAGGACG-3’)，以逐級稀釋好的質(zhì)粒為模板，qPCR測定拷貝數(shù)和Ct值之間的相關性，并擬合成直線。吸取混勻的病毒，抽提病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以 WPRE-F和 WPRE-R為qPCR引物，測定Ct值，利用已經(jīng)得到的標準曲線，計算出病毒拷貝數(shù)。由于病毒顆粒與病毒拷貝數(shù)一一對應，即可計算出病毒的滴度。

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嘌呤霉素最佳篩選濃度的確定

取對數(shù)生長期Raji細胞，按每孔5×105個接種于6孔板中，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。嘌呤霉素按0，0.5，1，1.5，2，3μg/mL設置6個濃度梯度。在細胞接種24h后，將配制好的嘌呤霉素加入96孔板中，每個濃度設置3個重復孔，每天觀察細胞生長情況，在48h內(nèi)全部死亡的最低嘌呤霉素濃度，即為篩選表達熒光素酶的Raji克隆細胞的濃度。

5

慢病毒對Raji細胞的感染，陽性細胞

的篩選及擴增

取對數(shù)生長期的Raji細胞5×105接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，加入濃縮后的病毒，以感染復數(shù)(MultiplicityOfInfection，MOI)=5感染Raji細胞，并加入終濃度為8μg/mL的polybrene，加入1mLRPMI1640完全培養(yǎng)基，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置感染24h后換成含10%胎牛血清的 RPMI1640新鮮完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24~48h，培養(yǎng)基變黃時，更換新鮮培養(yǎng)基。向慢病毒感染后72h的Raji細胞中加入合適濃度的嘌呤霉素，每兩天更換一次培養(yǎng)基并維持嘌呤霉篩選直至得到陽性混合細胞。取1×10000個細胞加入熒光素酶底物，初步鑒定熒光素酶的表達；將嘌呤霉素篩選濃度提升到3倍，篩選熒光素酶高表達陽性克隆細胞，命名為Raji-luc+。

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熒光素酶活性鑒定

將Raji-luc+細胞傳代5~10次，收集一定量細胞，按梯度稀釋于96孔板中，每孔 Raji-luc+細胞數(shù)分別為2×104，1×104，5000，2500，1250，625，312，0個，用熒光素酶底物(Promega)，酶標儀檢測細胞發(fā)光情況，檢測細胞發(fā)光強度和細胞數(shù)之間的相關性；進一步使用活體成像對每孔Raji-luc+細胞數(shù)分別為4×104，2×104，1×104，5000，2500，1250，625個及4×104個Raji細胞的96孔板成像。

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NCG小鼠血液腫瘤模型的建立

隨機將4~5周，體重15~20g，5只雌性NCG小鼠分成兩組，空白對照(mock)組小鼠，實驗組小鼠(n=4)每只尾靜脈注射 Raji-luc+細胞1×106個。實驗組取對數(shù)生長期的Raji細胞，用PBS重懸細胞密度為1×107/mL，實驗組每只小鼠尾靜脈注射100μL；mock組尾靜脈注射100μLPBS，接種后第0d，9d，12d，15d，活體成像儀檢測腫瘤成瘤情況。檢測前使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠(計量為35mg/kg)，嚴格按照Promega說明書注射底物，10min內(nèi)，進行活體成像分析腫瘤生長情況，并繪制小鼠體重變化曲線。