易基因：全基因組DNA甲基化和小RNA分析揭示甘藍型油菜種子的基因組不對稱性
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多倍體是被子植物基因組進化中的一種持續(xù)現象，有助于現存開花植物的多樣性。甘藍型油菜（Brassica napus）是世界上最重要的被子植物油料作物品種之一，起源于Brassica rapa（An）和Brassica oleracea（Cn）的種間雜交。盡管轉錄組學中基因組優(yōu)勢的趨勢開始顯現，但多倍體在生殖發(fā)育過程中的表觀遺傳學和小RNA（small RNA，sRNA）調控機制知之甚少。種子是向新孢子體代的關鍵發(fā)育過渡，并隨時間發(fā)生表觀遺傳修飾。雙二倍體（amphidiploids）種子發(fā)育的協調需要祖細胞（Progenitor cell）基因組的表觀遺傳平衡。雖然DNA甲基化和RNA干擾是支持發(fā)育的關鍵過程，但將它們與種子發(fā)育聯系起來的許多細節(jié)仍在出現，尤其是在異源多倍體中。
2023年05月17日，加拿大曼尼托巴大學生物科學系Mark F Belmonte團隊在《The Plant Journal》雜志發(fā)表題為“Genomic asymmetry of the Brassica napus seed: epigenetic contributions of DNA methylation and small RNAs to subgenome bias”的研究論文，該研究利用WGBS和sRNA-seq等實驗揭示了DNA甲基化和小RNA在甘藍型油菜種子亞基因組偏好中的表觀遺傳作用。
標題：Genomic asymmetry of the Brassica napus seed: epigenetic contributions of DNA methylation and small RNAs to subgenome bias（甘藍型油菜種子的基因組不對稱性：DNA甲基化和小RNA對亞基因組偏好的表觀遺傳貢獻）
時間：2023-05-17
期刊：The Plant Journal
影響因子：IF 7.091
技術平臺：WGBS、sRNA-seq等
研究摘要
本研究分析了甘藍型油菜（B. napus）種子發(fā)育過程中，An和Cn兩個亞基因組以及祖代縮減的基因組（ancestral fractionated genome）中DNA甲基化和小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）圖譜的偏好發(fā)生率。研究結果表明，Cn亞基因組的siRNA表達和胞嘧啶甲基化的普遍存在偏好，其中Cn亞基因組啟動子區(qū)域的DNA甲基化尤為富集。此外甘藍型油菜祖代三倍體亞基因組中的siRNA轉錄模式是保守的，而在An和Cn兩個亞基因組中不保守。從基因組縮減和多倍體化角度研究了甘藍型油菜種子的甲基化模式與基因、啟動子區(qū)域、siRNA位點和轉座元件（transposable element，TE）相關。本研究為甘藍型油菜種子發(fā)育過程中選擇性沉默Cn亞基因組的表觀遺傳調控提供了證據，并探討了基因組縮減對甘藍型油菜種子表觀遺傳組分的影響。
（a） 從配子體發(fā)生（gametogenesis）到成熟期結束，種子發(fā)育可分為5個離散時期：胚珠期（ovule，OV）、球形期（globular，GLOB）、心形期（heart）、綠熟期（mature green，MG）和干種子期（dry seed，DS）。所有五個時期進行sRNA-seq測序分析，同時對球形期（GLOB）和綠熟期（MG）的種子進行全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS），GLOB期和MG期分別代表了形態(tài)發(fā)生和成熟開始的關鍵發(fā)育轉變。
（b） 共線性圖顯示了雙二倍體甘藍型油菜基因組中每條染色體最大的連續(xù)共線性區(qū)，Brassica rapa（Br）的An亞基因組，Brassica oleracea（Bo）的Cn亞基因組。
（c） 表觀遺傳保守性的假設模型——基因組的broad共線區(qū)表明兩個亞基因組之間的高度保守。這些區(qū)域的保守可能導致生殖中類似的表觀遺傳結構。
圖1：甘藍型油菜種子發(fā)育的表觀遺傳模型假設
從配子體發(fā)生（gametogenesis）到成熟期結束，種子發(fā)育可分為5個離散時期：胚珠期（ovule，OV）、球形期（globular，GLOB）、心形期（heart）、綠熟期（mature green，MG）和干種子期（dry seed，DS）。所有五個時期進行sRNA-seq測序分析，同時對球形期（GLOB）和綠熟期（MG）的種子進行全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS），GLOB期和MG期分別代表了形態(tài)發(fā)生和成熟開始的關鍵發(fā)育轉變。
共線性圖顯示了雙二倍體甘藍型油菜基因組中每條染色體最大的連續(xù)共線性區(qū)，Brassica rapa（Br）的An亞基因組，Brassica oleracea（Bo）的Cn亞基因組。
表觀遺傳保守性的假設模型——基因組的broad共線區(qū)表明兩個亞基因組之間的高度保守。這些區(qū)域的保守可能導致生殖中類似的表觀遺傳結構。
研究結果
（1）甘藍型油菜種子甲基化組單堿基分辨率圖譜揭示了Cn亞基因組偏好
（a） 平均胞嘧啶甲基化水平。顯示球形期（GLOB，綠色）、綠熟期（MG，藍色）和質體（plastidial，灰色）基因組所有覆蓋胞嘧啶的平均甲基化。
（b） 甘藍型油菜An和Cn兩個亞基因組中甲基化縮減的基因組水平：最少縮減（LF）、最多縮減（MF1和MF2）。分位數箱線圖顯示在CG、CHG和CHH中，葉片、GLOB期種子和MG期種子的共線性區(qū)域1 kB窗口中的胞嘧啶甲基化水平
（2）啟動子元件的差異甲基化靶向參與甘藍型油菜種子碳代謝和發(fā)育的基因
（a） 百分比堆積柱形圖顯示球形期（GLOB）種子和綠熟期（MG）種子以及葉片之間的高甲基化和低甲基化基因（GENE）、1 kb上游調控區(qū)（啟動子，PROM）和轉座元件（transposable element,TE）。分別為GLOB期種子（橙色）或MG期種子（淺橙色）中的高甲基化，GLOB期種子（黃色）或MG期種子（淺黃色）中的低甲基化，GLOB期種子和MG期種子中的高甲基化（深藍）或低甲基化（淺藍）。
（b） 種子發(fā)育GLOB期和MG期的啟動子差異甲基化基因GO富集分析。深色表示高度富集。
（3）相對于其他蛋白質編碼基因，轉錄因子（TF）低甲基化
（4）縮減的基因組在基因和啟動子上表現出不同的甲基化
以甘藍型油菜（Brassica napus）的縮減基因組（最少縮減(LF)、最多縮減(MF1、MF2)）及其對應的亞基因組（A、C）劃分的箱型圖和晶須圖。
（5）種子成熟以轉錄的siRNA位點數量增加為表征
（a） 種子發(fā)育不同時期的文庫中總siRNA位點的reads/M（RPM）比例表現出出一致的Cn亞基因組偏好。
（b） 在種子發(fā)育早期，較少siRNA位點占總reads較大比例，而reads在綠熟期（MG）比胚珠期（OV）、球形期（GLOB）、心形期（heart）分布更均勻。
（6）甘藍型油菜種子中轉座元件（TE）和基因啟動子區(qū)域編碼大部分轉錄sRNA
（a） siRNA在種子發(fā)育全過程中以一致的Cn亞基因組偏好性積累。
（b） 源于基因體的siRNA在DS期積累最強，數量少于由啟動子區(qū)編碼的siRNA。
（c） 啟動子區(qū)siRNA在綠熟期（MG）表達最為富集，從胚珠期（OV）到MG期表達增加。啟動子區(qū)域比基因體編碼的siRNA表現出更強的亞基因組偏好。
（d） 對與啟動子區(qū)域相關的編碼基因（每個種子階段最高表達的500個siRNA簇）進行GO富集分析，該啟動子區(qū)域編碼每個種子階段最高表達的500個siRNA簇。
（7）祖代基因組縮減對種子發(fā)育過程中的siRNA積累影響不大
（8）基因組縮減對非蛋白編碼元件的影響小于對基因體和啟動子區(qū)域的影響
（a）球形期（GLOB）、（b）綠熟期（MG）、（c）GLOB-MG的比較。
結論
總之，本研究為甘藍型油菜種子中Cn亞基因組的表觀遺傳偏好和基因組中非蛋白編碼元件的表觀遺傳調控機制提供了證據。本研究數據表明，基因組縮減并沒有實質性地改變轉座子和種子發(fā)育過程中calling的siRNA甲基化譜。種子的表觀遺傳結構可能是決定甘藍型油菜進化軌跡的重要因素，尤其與多倍體作物相關。
關于易基因全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）技術
全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS）可以在全基因組范圍內精確的檢測所有單個胞嘧啶堿基（C堿基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金標準。WGBS能為基因組DNA甲基化時空特異性修飾的研究提供重要技術支持，能廣泛應用在個體發(fā)育、衰老和疾病等生命過程的機制研究中，也是各物種甲基化圖譜研究的首選方法。
易基因提供的全基因組甲基化測序技術通過T4-DNA連接酶，在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列，連接產物通過重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉變?yōu)槟蜞奏，進而通過接頭序列介導的 PCR 技術將尿嘧啶U轉變?yōu)樾叵汆奏。
應用方向：
WGBS廣泛用于各種物種，要求全基因組掃描（不錯過關鍵位點）
全基因組甲基化圖譜課題
標志物篩選課題
小規(guī)模研究課題
技術優(yōu)勢：
應用范圍廣：適用于所有參考基因組已知物種的甲基化研究；
全基因組覆蓋：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息，精確繪制甲基化圖譜；
單堿基分辨率：可精確分析每一個C堿基的甲基化狀態(tài)。
參考文獻：
Ziegler DJ, Khan D, Pulgar-Vidal N, Parkin IAP, Robinson SJ, Belmonte MF. Genomic asymmetry of the Brassica napus seed: epigenetic contributions of DNA methylation and small RNAs to subgenome bias. Plant J. 2023 May 17. doi: 10.1111/tpj.16254. PubMed PMID: 37195091.
