胰腺癌（PC）是一種具有毀滅性的惡性腫瘤，特點(diǎn)是：診斷延遲、轉(zhuǎn)移、發(fā)生率高、預(yù)后不良和化療不敏感[1]。值得注意的是，PC患者的五年生存率低于5%，并且重要特征是缺氧[2]。盡管外科手術(shù)和化學(xué)療法一直在發(fā)展，PC的預(yù)后仍然令人失望。因此，迫切需要確定PC的早期診斷生物標(biāo)志物、分子機(jī)制和功能治療靶點(diǎn)。

circRNA（環(huán)狀RNA）是一種通過選擇性剪接形成的非編碼RNA。circRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其難以在體內(nèi)降解，并在腫瘤和血清外泌體中特異性表達(dá)。因此，circRNA可被視為腫瘤發(fā)生的有效RNA生物標(biāo)志物。就機(jī)制而言，研究表明circRNA可能通過充當(dāng)ceRNA來海綿miRNA或充當(dāng)支架來調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展[3]。并且外泌體攜帶的circRNA可在細(xì)胞間通信中發(fā)揮重要作用。

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院瑞金醫(yī)院胰腺疾病中心普通外科沈柏用教授在Journal of Hematology & Oncology?發(fā)表文章：Hypoxia-induced exosomal circPDK1 promotes pancreatic cancer glycolysis via c-myc activation by modulating miR-628-3p/BPTF axis and degrading BIN1。文章指出：circPDK1在PC腫瘤組織和血清外泌體中高度豐富，并與PC不良生存率相關(guān)。外泌體circPDK1在體外和體內(nèi)顯著促進(jìn)PC細(xì)胞增殖、遷移和糖酵解。從機(jī)制上講，HIF1A通過激活宿主基因PDK1上調(diào)circPDK1，circPDK1通過調(diào)節(jié)miR-628-3p/BPTF軸和降解BIN1激活c-myc，從而促進(jìn)PC生成。本文章提出，外泌體circPDK1可能是PC診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1、RNA-seq測序鑒定低氧PC細(xì)胞外泌體中的環(huán)狀RNA

缺氧可增加PC細(xì)胞的外泌體分泌。而circRNA在外泌體中大量穩(wěn)定存在，在癌癥中可能是關(guān)鍵調(diào)控因子，這已被廣泛證實(shí)[4]。作者使用RNA-seq測序檢測從常氧和低氧PC細(xì)胞中純化的外泌體，共鑒定出78個差異表達(dá)的circRNA，用qRT-PCR在癌癥和癌旁組織中，分析前5個上調(diào)和下調(diào)的circRNA，發(fā)現(xiàn)circPDK1是PC中上調(diào)最多的circRNA。然后，在大量的癌癥和癌旁的組織芯片中進(jìn)行ISH檢測，結(jié)果顯示，circPDK1在腫瘤組織中比在配對的正常組織中更豐富。隨后，作者又選取110例配對的術(shù)后PC組織和正常組織，采用qRT-PCR方法分析circPDK1的表達(dá)。結(jié)果顯示，circPDK1在PC中顯著上調(diào)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、晚期病理分期和不良預(yù)后呈正相關(guān)。

circRNA在血清外泌體中被廣泛檢測到，并被認(rèn)為是血清外泌體中潛在的腫瘤標(biāo)志物。因此，為了探索circPDK1是否可以在血清外泌體中檢測到，以及它作為腫瘤標(biāo)志物的潛力，作者收集了20名PC患者和10名健康個體的血液樣本作為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來自血清外泌體的circPDK1在PC患者中大量表達(dá)，而在健康對照組中幾乎不存在。綜上所述，circPDK1在PC中顯著上調(diào)，并與PC的不良預(yù)后相關(guān)，可在血清外泌體中穩(wěn)定傳遞和富集。這表示，circPDK1可作為PC的早期診斷的circRNA生物標(biāo)志物。

02、circPDK1特性

circPDK1 (has_circ_0057104)由PDK1的第7-10外顯子生成，長度為401 nt，通過Sanger測序和背靠背引物驗(yàn)證鑒定circPDK1的成環(huán)效應(yīng)。RNase R或放線菌素D處理表明，circPDK1在PC細(xì)胞中穩(wěn)定。亞細(xì)胞分離和FISH分析結(jié)果顯示，circPDK1主要定位在細(xì)胞質(zhì)。這些結(jié)果表明，circPDK1在PC中是一個豐富的、穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞質(zhì)circRNA。

3、缺氧環(huán)境下HIF1A促進(jìn)外泌體circPDK1表達(dá)

有研究表明，在缺氧條件下，大量外顯子衍生的circRNAs被HIF1A轉(zhuǎn)錄激活，其宿主線性基因由相同的pre-mRNA產(chǎn)生[5]。因此，作者推測低氧外泌體中大量的circPDK1可能是由于HIF1A激活的緣故。為了驗(yàn)證假設(shè)，作者首先發(fā)現(xiàn)circPDK1與其線性基因表達(dá)存在正相關(guān)。與此同時(shí)，circPDK1的表達(dá)也跟HIF1A的表達(dá)呈正相關(guān)。另外也發(fā)現(xiàn)HIF1A蛋白水平在PC中上調(diào)。作者又利用啟動子序列分析工具(UCSC和JASPAR)，在circPDK1啟動子區(qū)域的宿主基因中驗(yàn)證了兩個潛在的缺氧響應(yīng)元件(HREs) (ACACGTGCCC/GTACGTGAGG)。通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)確認(rèn)HIF1A直接與circPDK1的兩個轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相互作用。此外，對宿主基因上游的circPDK1啟動子區(qū)域的兩個預(yù)測HREs進(jìn)行ChIP分析表明，HIF1A可以直接結(jié)合PDK1啟動子區(qū)域，并在缺氧條件下增強(qiáng)宿主基因PDK1的轉(zhuǎn)錄。此外，HIF1A的敲低顯著抑制了缺氧誘導(dǎo)的胞內(nèi)和外泌體circPDK1的表達(dá)。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，在缺氧條件下circPDK1可以被激活。總之，這些結(jié)果表明，低氧下HIF1A的激活會上調(diào)外泌體中circPDK1表達(dá)。

4、細(xì)胞功能研究——缺氧下外泌體circPDK1促進(jìn)PC細(xì)胞體外和體內(nèi)增殖和遷移

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)——為了闡明缺氧下，外泌體circPDK1在PC中的作用，從MIA PaCa-2和PANC-1細(xì)胞中分離出不同豐度的circPDK1外泌體，并分別在常氧/低氧條件下（常氧外泌體、低氧外泌體、低氧NC外泌體和低氧sh1-circPDK1外泌體）與相應(yīng)的供體細(xì)胞共培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低氧下，外泌體中circPDK1顯示高豐度；但是，低氧的sh1-circPDK1組較低氧NC組，circPDK1的表達(dá)量下調(diào)。接下來，進(jìn)行集落形成、EdU、CCK-8和transwell檢測。結(jié)果顯示，低氧外泌體處理過的PC細(xì)胞活力和遷移能力增強(qiáng)/E-cadherin低表達(dá)/N-cadherin和vimentin高表達(dá)，而敲低circPDK1則逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果。

體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)——為了探討外泌體circPDK1在體內(nèi)的惡性作用，作者建立了裸鼠異種移植瘤模型(MIA PaCa-2細(xì)胞系)，并每3天靜脈注射各組小鼠一次MIA PaCa-2產(chǎn)生的外泌體(常氧外泌體、缺氧外泌體、缺氧NC外泌體和缺氧sh1-circPDK1外泌體)。注射完成后，取小鼠腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)低氧的NC外泌體（circPDK1高表達(dá)）增加了異種移植瘤的體積和重量以及肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，而低氧的sh1-circPDK1外泌體消除了這一結(jié)果。IHC檢測PCNA、E-cadherin和vimentin發(fā)現(xiàn)，circPDK1高表達(dá)也促進(jìn)PCNA和vimentin表達(dá)以及/N-cadherin低表達(dá)，而sh1-circPDK1結(jié)果與之相反。體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，均表明缺氧誘導(dǎo)的外泌體circPDK1在體內(nèi)促進(jìn)PC細(xì)胞生長和遷移。

5、機(jī)制探索1——在PC中circPDK1起miR 628 3p海綿的作用

鑒于circPDK1定位于細(xì)胞質(zhì)，作者假設(shè)circPDK1可能通過作為miRNAs海綿發(fā)揮ceRNA的作用。通過circinteractome數(shù)據(jù)庫和RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了circPDK1與AGO2結(jié)合。這顯示，circPDK1可能起到miRNA海綿的作用。隨后，miRNA測序來篩選對照組和circPDK1過表達(dá)組中的差異表達(dá)的miRNA。在候選的miRNA中，miR-628-3p在過表達(dá)circPDK1的MIA PaCa-2細(xì)胞中被嚴(yán)重抑制，并且RIP實(shí)驗(yàn)也表明miR-628-3p可以與AGO2結(jié)合。作者進(jìn)一步在TCGA和自己的數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，miR-628-3p在PC腫瘤中顯著下調(diào)并與與不良預(yù)后相關(guān)，并且與circPDK1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。作者通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測發(fā)現(xiàn)miR-628-3p和circPDK1存在結(jié)合。此外，亦做了circPDK1對miR-628-3p的啟動子區(qū)域、pri-miRNA和pre-miRNA的影響，排除了circPDK1調(diào)控miR-628-3p的啟動子活性或pri-miRNA和pre-miRNA生成。綜上所述，circPDK1可能與miR-628-3p相互作用，在PC細(xì)胞中充當(dāng)miR-628-3p的ceRNA海綿。

5-1、circPDK1作為miR-628-3p的ceRNA促進(jìn)BPTF的表達(dá)

miR-628-3p在PC中的潛在功能和作用機(jī)制尚不清楚。因此，作者探索了circPDK1-miR-628-3p軸的潛在靶點(diǎn)—使用mirDIP、RNAInter、miRDB、miRTarBase和TargetScan數(shù)據(jù)庫，預(yù)測BPTF、PURA、RBFOX2和ARSJ是miR-628-3p的潛在下游靶點(diǎn)。TCGA數(shù)據(jù)分析顯示，BPTF的表達(dá)與miR-628-3p呈負(fù)相關(guān)，而PURA、RBFOX2和ARSJ結(jié)果不同。circPDK1缺失后的RNA測序結(jié)果顯示，在37個下調(diào)的蛋白質(zhì)編碼基因中，BPTF是明顯下調(diào)的基因之一。此外作者通過基因集富集分析(GSEA)發(fā)現(xiàn)，BPTF是c-myc轉(zhuǎn)錄所必需的。也有報(bào)道BPTF/c-myc軸參與了PC細(xì)胞生長[6]。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-628-3p和BPTF存在結(jié)合，并且BPTF與circPDK1表達(dá)表達(dá)水平呈正相關(guān)，但是miR-628-3p的過表達(dá)會抑制circPDK1激活BPTF/c-myc軸。總體而言，circPDK1作為ceRNA通過發(fā)揮miR-628-3p海綿作用，釋放miR-628-3p抑制的BPTF，從而調(diào)節(jié)BPTF/c-myc軸，促進(jìn)PC生成。

6、機(jī)制探索2——circPDK1與BIN1相互作用，增強(qiáng)BIN1的泛素化

作者使用RNA pulldown實(shí)驗(yàn)和銀染研究了circPDK1是否通過與RNA結(jié)合蛋白相互作用來發(fā)揮其功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量的200、120、75、65和35 kDa蛋白與circPDK1相關(guān)。質(zhì)譜分析顯示，BIN1是circPDK1最可能的RNA結(jié)合蛋白之一。隨后，RNA pulldown和免疫沉淀驗(yàn)證BIN1與circPDK1互作。FISH分析顯示circPDK1在細(xì)胞質(zhì)中與BIN1共定位。敲低circPDK1雖不改變BIN1的mRNA水平，但可上調(diào)BIN1蛋白水平，反之結(jié)果相反。作者特異研究了與BIN1相互作用的circPDK1區(qū)域，發(fā)現(xiàn)主要是circPDK1后半段序列與BIN1相互作用。因此，作者假設(shè)circPDK1可能通過與BIN1蛋白相互作用而破壞它。并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，敲低circPDK1顯著抑制BIN1的泛素化水平，反之則增強(qiáng)了BIN1的泛素化水平。作者又運(yùn)用原子旋轉(zhuǎn)等變記分器(ARES)分析circPDK1與BIN1結(jié)合的三維結(jié)構(gòu)，并找出了它們的結(jié)合位置是在BAR區(qū)域，隨后又設(shè)計(jì)了pulldown和IHC試驗(yàn)加以驗(yàn)證。綜上所述，circPDK1可能通過與BIN1的BAR結(jié)構(gòu)域相互作用來調(diào)節(jié)BIN1的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)其泛素依賴性降解。

6-1、circPDK1作為支架，增強(qiáng)了BIN1與UBE2O的結(jié)合

為了進(jìn)一步解析circPDK1介導(dǎo)的BIN1泛素化，作者通過質(zhì)譜分析RNA puldown產(chǎn)物篩選出UBE2O（可顯示E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶活性）。RNA pull-down和RIP確認(rèn)了circPDK1與UBE2O之間的相互作用。而Co-IP(免疫共沉淀)結(jié)果顯示UBE2O也與BIN1結(jié)合。巧的是，F(xiàn)ISH和IF檢測表明circPDK1、UBE2O和BIN1主要在細(xì)胞質(zhì)中共定位。qRT-PCR結(jié)果顯示，UBE2O不影響B(tài)IN1和circPDK1的RNA水平，但UBE2O下調(diào)后BIN1蛋白水平明顯升高。而敲低circPDK1顯著減弱了UBE2O對BIN1泛素化和降解的影響。IHC實(shí)驗(yàn)還顯示，PC組織（circPDK1高表達(dá)）中UBE2O蛋白水平升高，且與BIN1呈負(fù)相關(guān)。總的來說，circPDK1可以作為一個支架，增強(qiáng)UBE2O與BIN1的結(jié)合，從而促進(jìn)UBE2O對BIN1泛素化和降解的影響。

7、circPDK1通過激活c myc促進(jìn)糖酵解

有報(bào)道講，BIN1是一種腫瘤抑制因子，可與c-myc相互作用，限制c-myc的轉(zhuǎn)錄活性[7]。作者通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，circPDK1和UBE2O可以通過降解BIN1蛋白激活c-myc的轉(zhuǎn)錄活性。為了探索這兩個軸之間是否存在交叉激活，作者檢測了BIN1和UBE2O對miR-628-3p和BPTF表達(dá)的影響。結(jié)果表明，BIN1和UBE2O不影響miR-628-3p或BPTF的表達(dá)。同時(shí)，miR-628-3p或BPTF不能在RNA或蛋白質(zhì)水平調(diào)控BIN1或UBE2O，這表明circPDK1可以通過兩個無交叉的軸激活c-myc。

已知c-myc是Warburg效應(yīng)的關(guān)鍵介導(dǎo)因子，它直接激活各種糖酵解靶基因，以滿足快速增殖和轉(zhuǎn)移的需要[8]。因此，作者探索了circPDK1是否與糖酵解相關(guān)。通過qRT-PCR和Western blotting對糖酵解基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低circPDK1對這些糖酵解基因的表達(dá)沒有明顯的抑制作用，僅僅是減少乳酸和ATP的產(chǎn)生和葡萄糖的攝入，以及細(xì)胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)。但是PET-CT掃描顯示敲低circPDK1會顯著抑制小鼠皮下腫瘤中的葡萄糖代謝，并且敲低circPDK1會抑制c-myc活性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，BIN1逆轉(zhuǎn)了circPDK1過表達(dá)誘導(dǎo)的糖酵解，miR-628-3p結(jié)果與之類似，二者也均能抑制c-myc活性。同時(shí)，敲低circPDK1和過表達(dá)BIN1也會抑制UBE2O誘導(dǎo)的糖酵解電位。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明c-myc介導(dǎo)了circPDK1在糖酵解中的作用。

綜上所述：circPDK1在低氧PC細(xì)胞衍生的外泌體中高度富集。高表達(dá)的circPDK1表達(dá)與PC患者不良預(yù)后密切相關(guān)。外泌體circPDK1通過促進(jìn)細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移和體內(nèi)外糖酵解，在PC中具有促進(jìn)腫瘤生長的作用。機(jī)制上講，HIF1A通過激活宿主基因PDK1上調(diào)circPDK1，circPDK1通過調(diào)節(jié)miR-628-3p/BPTF軸和降解BIN1激活c-myc。這項(xiàng)研究為circRNA/miRNA/mRNA和circRNA-RBP相互作用的多樣性提供了新的見解，并強(qiáng)調(diào)了其作為PC的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛在用途。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1186/s13045-022-01348-7

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