中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）與華大生命科學(xué)研究院、臨港實驗室、上海腦科學(xué)與類腦研究中心、騰訊AI Lab、瑞典皇家理工學(xué)院、卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院等單位聯(lián)合，通過對成年雄性獼猴的大腦左半球進行冠狀切片，結(jié)合華大自主研發(fā)的高分辨率時空組學(xué)技術(shù)Stereo-seq和snRNA-seq，繪制了全球首個非人靈長類全腦皮層空間單細胞圖譜。

該研究揭示了獼猴大腦皮層各細胞類型具有腦區(qū)和層依賴的定位模式，并特別指出各種細胞類型的區(qū)域分布與視覺和體感系統(tǒng)中各腦區(qū)的層級結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系?？缥锓N比較分析進一步揭示了在L4層富集的靈長類特異性細胞類型。該文章在2023年07月12日發(fā)表于Cell，在此，我們特邀請共同一作朱志勇對文章進行詳細解讀。

文章題目：Single-Cell Spatial Transcriptome Reveals Cell-Type Organization in Macaque Cortex

發(fā)表時間：2023-07-12

發(fā)表期刊：Cell

主要研究團隊：中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、華大生命科學(xué)研究院、臨港實驗室、上海腦科學(xué)與類腦研究中心、騰訊AI Lab、瑞典皇家理工學(xué)院、卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院等

影響因子：64.500

DOI：10.1016/j.cell.2023.06.009

研究背景

靈長類動物的大腦是最為復(fù)雜的器官，由超過60億個細胞組成，這些細胞根據(jù)其空間、分子、形態(tài)或生理特征可分為數(shù)百種細胞類型。其中，大腦皮質(zhì)是靈長類腦中最為龐大和發(fā)達的一塊神經(jīng)組織，與靈長類動物具有較高的認知和社交能力一致，它負責調(diào)節(jié)多種高級功能，包括感覺、語言和行為等。這些高級功能的實現(xiàn)需要依賴于不同細胞類型形成的特定神經(jīng)環(huán)路，這些細胞和環(huán)路的異常也導(dǎo)致了多種腦疾病。因此，系統(tǒng)解析大腦皮層中各種細胞類型的組成和空間分布，對于闡明靈長類動物大腦的組織模式至關(guān)重要，同時也為深入了解腦科學(xué)的復(fù)雜機制提供了珍貴資源。大視野時空組學(xué)技術(shù)Stereo-seq提供了厘米級組織切片測序的解決方案，使研究團隊能夠在全腦水平上以前所未有的分辨率繪制基因表達的立體空間分布圖，從而研究皮質(zhì)細胞的潛在多樣性和空間組織模式，以促進人們對靈長類大腦的深入了解。

研究樣本

大腦左半球組織采集自三只雄性食蟹獼猴（Macaca fasicularis；#1，6歲，4.2 kg；#2，4歲，3.7 kg；#3，7歲，10.6 kg）。

研究策略

研究人員利用Stereo-seq和snRNA-seq對獼猴大腦左半球的皮質(zhì)組織進行冠狀冷凍切片測序，并對轉(zhuǎn)錄組進行生物信息學(xué)分析。在snRNA-seq轉(zhuǎn)錄譜上鑒別出不同的細胞類型，研究基于半監(jiān)督DNN模型構(gòu)建了從單細胞到空間的細胞類型遷移注釋分類器，將snRNA-seq上的細胞分型穩(wěn)健地注釋到空間組單細胞水平上。同時，研究人員通過免疫組化染色和顯微掃描成像輔助識別切片組織解剖結(jié)構(gòu)，從而繪制出整個大腦皮質(zhì)不同腦區(qū)、不同皮層的單細胞水平3D轉(zhuǎn)錄組圖譜。然后，研究人員通過定量分析Stereo-seq數(shù)據(jù)，來探究獼猴皮層各細胞類型的空間組織模式，并特別探索腦區(qū)細粒度與視覺和體感系統(tǒng)層級結(jié)構(gòu)的內(nèi)在聯(lián)系，以了解不同皮質(zhì)區(qū)域功能差異的基礎(chǔ)和細胞組織規(guī)律。由于新皮質(zhì)的擴張是靈長動物出現(xiàn)復(fù)雜認知的關(guān)鍵，因此，研究人員收集了之前研究公開的不同哺乳動物（人、鼠）的單細胞數(shù)據(jù)集并進行跨物種比較分析，以解析靈長動物新皮質(zhì)擴張的進化特點。

研究成果

1.?獼猴大腦皮層細胞的全面分型

研究人員首先對來自兩只獼猴的單細胞轉(zhuǎn)錄譜進行整合、聚類分析，構(gòu)建了一個三級的細胞層級分型樹。一級分型包括了谷氨酸能神經(jīng)元、GABAergic神經(jīng)元和非神經(jīng)元細胞。二級確定了一級分型的主要亞型，其中谷氨酸能神經(jīng)元亞型通過其層分布偏好注釋（L代表層：L2、L2/3、L2/3/4、L3/4、 L3/4/5、L4、L4/5、L4/5/6、L5/6 和 L6），GABAergic神經(jīng)元亞型根據(jù)標記基因LAMP5、VIP、RELN、PVALB和SST的表達注釋，非神經(jīng)元細胞由標記基因注釋了星形膠質(zhì)細胞（astrocytes，ASCs）、少突膠質(zhì)前體細胞 （oligodendrocyte precursor cells，OPCs）、少突膠質(zhì)細胞（oligodendrocytes，OLG）、小膠質(zhì)細胞（microglic，MG）、內(nèi)皮細胞（endothelial cells，ECs）和血管軟腦膜細胞（vascular leptomeningeal cells，VLMCs）。三級分型是對二級分型的細化，在整個大腦皮質(zhì)143個區(qū)域上總鑒定出?264個細胞簇。這種結(jié)合了空間轉(zhuǎn)錄組信息的snRNA-seq分析產(chǎn)生了獼猴大腦皮層的全面細胞類型分類（圖2）。

2.?獼猴大腦皮層不同細胞類型的空間分布

研究人員使用大型硅基芯片（最大5 cm×3 cm）對獼猴半球冠狀位切取的10 μm厚度組織切片進行Stereo-seq分析，以捕獲細胞的mRNA分子。每張Stereo-seq切片均用ssDNA和ConA進行染色后掃描成像（圖3A），并使用自主開發(fā)的AI自動分割算法進行單細胞識別。隨后，研究人員基于弱監(jiān)督神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建了從單細胞到空間細胞類型遷移注釋的分類器，穩(wěn)健地將snRNA-seq上鑒定的264類細胞類型注釋到空間組單細胞上，為所有三只猴構(gòu)建了單細胞解析的細胞類型3D皮質(zhì)圖譜（圖3D）。

對Stereo-seq 3D圖譜的定量分析，研究人員發(fā)現(xiàn)了各腦區(qū)的細胞組成以功能腦葉差異的模式被分割聚集在一起的特點（圖3G）。由于相互靠近的細胞往往具有更高形成突觸連接的可能，細胞類型在空間上的局部混合很可能表明局部神經(jīng)環(huán)路的差異源于細胞組成。因此，研究人員量化分析了各個皮質(zhì)層中局部細胞類型組成的“鄰域復(fù)雜性”，發(fā)現(xiàn)細胞類型在不同的皮質(zhì)層和區(qū)域上確實會表現(xiàn)出鄰域組成的特異性，如較深皮質(zhì)層的復(fù)雜性高于表層（圖3H~3I），且皮質(zhì)區(qū)域之間也存在著明顯差異（圖3J）。

3. 細胞類型組成和分布與皮質(zhì)層級結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)

基于Stereo-seq細胞類型圖譜，研究人員通過分析皮質(zhì)腦區(qū)間的細胞密度差異，發(fā)現(xiàn)細胞密度和先前為靈長類動物視覺和體感系統(tǒng)定義的層級結(jié)構(gòu)水平間存在顯著負相關(guān)（圖4A~4B），該結(jié)果支持了層級結(jié)構(gòu)中較高級別腦區(qū)表現(xiàn)出較低細胞密度的概念。

進一步的分析顯著表現(xiàn)出層級依賴性變化的細胞類型（圖4G），研究人員發(fā)現(xiàn)其中部分細胞類型的分布在兩個層級系統(tǒng)上擁有一致表現(xiàn)。特別有趣的是，其中許多表現(xiàn)出負相關(guān)且在兩個系統(tǒng)中普遍存在的谷氨酸能神經(jīng)元會優(yōu)先定位于早期感覺通路（圖4E-~4F）。GO分析顯示，它們的標記基因與鈣離子結(jié)合、跨突觸信號傳導(dǎo)和離子通道活性相關(guān)。這些結(jié)果提示了獼猴大腦中細胞組織的一般規(guī)律。

4.?谷氨酸能神經(jīng)元的空間組織模式

研究人員使用Stereo-seq解析獼猴皮層組織中最大的細胞群——谷氨酸能神經(jīng)元，空間定位顯示這些細胞在不同腦區(qū)表現(xiàn)出明顯的層偏好（圖3D~3F、5A），這與先前在小鼠和靈長類動物中的發(fā)現(xiàn)一致。研究人員還進一步解析了幾種高度定位于特定的皮質(zhì)區(qū)域的谷氨酸能神經(jīng)元，例如V1腦區(qū)特異的細胞類型具有高表達NTNG1的特點（圖5G），該基因在神經(jīng)元發(fā)育過程中引導(dǎo)軸突生長，且與精神分裂癥相關(guān)。

鑒于谷氨酸能受體對于驅(qū)動皮質(zhì)回路中的信息處理的關(guān)鍵作用，研究人員進一步分析了谷氨酸能受體基因的空間分布，并發(fā)現(xiàn)這些受體亞基在皮質(zhì)層和腦區(qū)間具有差異表達（圖5J）。這里值得注意的是，研究人員觀察到GRIN2B的表達水平隨著視覺和體感系統(tǒng)中腦區(qū)層級水平的增加而增加，與先前人類皮質(zhì)層級中NMDAR-GluN2B表達增加的分析相一致（圖5J）。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)許多其他谷氨酸能受體基因的表達水平與感覺系統(tǒng)中各腦區(qū)的層級結(jié)構(gòu)水平具有正向關(guān)聯(lián)。綜合表明，谷氨酸能受體基因的協(xié)調(diào)表達模式可能是不同大腦區(qū)域突觸功能和可塑性差異的分子基礎(chǔ)。

5. GABAergic神經(jīng)元的空間組織模式

接下來，研究人員對GABAergic神經(jīng)元空間分布進行系統(tǒng)解析，發(fā)現(xiàn)GABAergic神經(jīng)元的7個亞型[RELN、LAMP5、VIP、VIP-RELN、PV、SST、CHC（chandelier subclass）]都顯示跨皮質(zhì)區(qū)域的層狀定位特點（圖6A）。細胞類型的腦區(qū)群體豐度顯示，CHC在前額葉和扣帶皮層中的突出分布與人類皮質(zhì)中的CHC類似（圖6B）。細胞類型的跨腦區(qū)密度比較分析中，研究人員發(fā)現(xiàn)兩群沿前-后（anterior-posterior，A-P）軸表現(xiàn)出豐度互補的SST樣神經(jīng)元；無監(jiān)督聚類顯示，它們的組成可以簡單區(qū)分9個皮質(zhì)葉，對維持皮質(zhì)區(qū)域功能差異可能具有潛在貢獻（圖6E）。

CHC神經(jīng)元具有支配錐體神經(jīng)元的軸突初始段，控制著神經(jīng)元沖動的特性。研究人員對該類神經(jīng)元作了進一步解析。CHC1、CHC2亞型在標記基因表達和空間定位、鄰域組成上精細區(qū)分CHC3亞型（圖6F）。綜合表明，不同的CHC細胞與不同的谷氨酸能細胞形成不同的局部環(huán)路影響神經(jīng)活動。

由于控制輸出的PV和控制輸入的SST神經(jīng)元之間的比例會影響局部環(huán)路在腦區(qū)間的差異。研究人員為此特別檢查了PV和SST的平衡模式，第一主成分分析顯示，皮質(zhì)區(qū)域內(nèi)PV和SST神經(jīng)的組成細粒度與感覺系統(tǒng)的層級結(jié)構(gòu)水平高度相關(guān)（圖6J），意味著具有胞體和樹突靶向特性的PV和SST神經(jīng)元受到嚴格調(diào)節(jié)，以支持各種感覺系統(tǒng)的功能。此外，PV/SST神經(jīng)元中神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)受體的基因表達與兩個感覺系統(tǒng)的層次水平之間存在顯著相關(guān)性（圖6K），表明PV和SST在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)處理的多個階段中具有響應(yīng)局部調(diào)節(jié)的特點。

6.?非神經(jīng)元細胞的空間組織模式

通過snRNA-seq分析，研究主要鑒定了6種非神經(jīng)員細胞（ASC、OLG、OPC、MG、EC 和 VMLC）。這些非神經(jīng)元細胞的空間分布特點與中間神經(jīng)元有一定相似，顯示出跨皮質(zhì)區(qū)域的層狀定位模式（圖7A）。研究人員對非神經(jīng)元細胞類型的系統(tǒng)評估后，還發(fā)現(xiàn)了ASC、MG和OLG細胞類型沿A-P軸呈梯度分布的特點（圖7E）。

在細胞類型的全局解析中，研究人員確定了兩組分別定位在 L1和L6皮質(zhì)層的ASC細胞類型，L6富集的ASC中出現(xiàn)較高水平的谷氨酸能受體基因表達（圖7D），提示ASC類型對支持皮質(zhì)功能的潛在貢獻。對OLG的分析也獲得了類似的發(fā)現(xiàn)，兩種OLG細胞群分別沿A-P軸的內(nèi)側(cè)和后部區(qū)域集中分布（圖6E）。值得注意的是，研究人員發(fā)現(xiàn)了一類在F1腦區(qū)存在明顯富集的OLG.7?ANLN/MOBP細胞類型（圖7G）。由于周圍少突膠質(zhì)細胞為其周圍的神經(jīng)元提供代謝支持，F(xiàn)1富集的OLG細胞類型可以滿足該區(qū)域神經(jīng)元沖動時更高的能量需求。綜合表明，獼猴大腦皮質(zhì)中這些非神經(jīng)細胞類型具有腦區(qū)和皮質(zhì)層中功能特異的特性。

7. 跨物種比較分析揭示靈長類動物特異性細胞類型

研究人員為了探索靈長類動物發(fā)生皮質(zhì)擴張的進化事件，將獼猴前額葉、運動皮質(zhì)和視覺皮質(zhì)的scRNA-seq數(shù)據(jù)與之前已發(fā)表的人類和小鼠皮質(zhì)研究中檢索到的數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)比較。在谷氨酸能細胞簇中，發(fā)現(xiàn)人類和獼猴相比，小鼠在PFC、M1、V1皮質(zhì)區(qū)域特有的一組谷氨能神經(jīng)元，它們由6種L4亞型組成（圖8A~8C）。這組靈長類特有的神經(jīng)元高度表達一些人類疾病相關(guān)基因，包括FOXP2、EPHA3和DCC（圖8G），且這些基因部分在空間上表現(xiàn)出區(qū)域依賴性的層狀表達（圖8H）。因此，研究人員推斷，靈長類皮質(zhì)的進化擴張伴隨著L4皮質(zhì)層靈長類特異性細胞類型的出現(xiàn)，還包括了FOXP2、EPHA3和DCC等基因的區(qū)域依賴性層狀差異表達模式。

?總結(jié)與展望?

本研究中，研究人員聯(lián)合Stereo-seq和snRNA seq，在單細胞水平上對整個獼猴的大腦皮質(zhì)組織進行全面的空間轉(zhuǎn)錄組分析，系統(tǒng)表征了興奮性神經(jīng)元、抑制性神經(jīng)元和非神經(jīng)細胞亞型的分子指紋和空間組織模式。該研究使用數(shù)據(jù)的可重復(fù)性通過三只猴子在相似冠狀坐標切片的基因表達譜和細胞組成映射中得到了證實。

本研究在谷氨酸能和GABAergic神經(jīng)元內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量由轉(zhuǎn)錄組定義的細胞類型。研究人員特別發(fā)現(xiàn)了高度表達ADCYAP1的L2/3谷氨酸能神經(jīng)元，由于ADCYAP1基因碼驅(qū)動cAMP信號傳導(dǎo)的肽，并充當神經(jīng)系統(tǒng)中應(yīng)激信號傳導(dǎo)的“主調(diào)控因子”。先前根據(jù)激光捕獲顯微切割的結(jié)果表明，ADCYAP1在恒河猴dlPFC的L3錐體細胞中富集。因此，研究人員提出這種跨皮質(zhì)區(qū)域且具有層特異性表達的基因需要進一步研究它在皮質(zhì)中的作用。

本研究揭示了幾個與皮質(zhì)腦區(qū)層級結(jié)構(gòu)相關(guān)的細胞組織規(guī)律。一是所有三種主要細胞類別都包含其腦區(qū)密度與感覺系統(tǒng)的皮質(zhì)層級呈顯著線性相關(guān)的細胞亞型；二是這些感覺系統(tǒng)間共享許多與層級結(jié)構(gòu)呈顯著線性相關(guān)的細胞類型；三是與層級結(jié)構(gòu)負相關(guān)的谷氨酸能細胞亞型的數(shù)量遠高于GABAergic細胞亞型；四是非神經(jīng)細胞類型的區(qū)域分布僅與層級結(jié)構(gòu)水平呈正相關(guān)。這些組織規(guī)律可能是隨著層級結(jié)構(gòu)信息處理復(fù)雜性不斷增加的細胞基礎(chǔ)，該研究結(jié)果為進一步研究不同細胞類型在不同層級皮質(zhì)區(qū)域中的具體作用提供了良好基礎(chǔ)。

考慮到前額葉、頂葉和顳葉皮質(zhì)的新皮質(zhì)擴張是靈長類進化中的重要一步，可能涉及靈長類特有的基因表達模式，而這些基因表達模式可能是形成復(fù)雜認知和行為功能的基礎(chǔ)。研究人員通過跨物種比較分析，揭示了靈長類特異性的L4細胞類型高度表達神經(jīng)精神風險基因FOXP2、肝配蛋白受體EPHA3和神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因DCC。未來進一步比較人類、非人類靈長類動物和嚙齒動物之間的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，將為靈長類動物大腦的進化和形態(tài)發(fā)生提供分子見解。

綜上，本研究提供了世界上首個在單細胞分辨率上全面的獼猴整個大腦皮質(zhì)組織空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，并為未來大腦組織在進化、發(fā)育、衰老和發(fā)病機制過程中的分子和細胞研究，為后續(xù)相關(guān)研究提供了重要的數(shù)據(jù)資源庫。

本研究中提供的數(shù)據(jù)資源：

數(shù)據(jù)集開發(fā)獲取網(wǎng)址：https://macaque.digital-brain.cn/spatial-omics。