單細(xì)胞測(cè)序、腫瘤干細(xì)胞等都是國自然中的熱點(diǎn)，那么他們?cè)趺床趴梢月?lián)系在一起的呢？2022年11月14日，濟(jì)寧醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院張斌教授團(tuán)隊(duì)在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF:12.658）發(fā)表了題為“AQP5 complements LGR5 to determine the fates of gastric cancer stem cells through regulating ULK1 ubiquitination”的研究論文。該研究對(duì)比了胃粘膜組織和胃癌組織的單細(xì)胞數(shù)據(jù)，鑒定了一種新型胃癌上皮細(xì)胞表面標(biāo)志物AQP5，并確定了AQP5通過與E3連接酶TRIM21相互作用并促進(jìn)關(guān)鍵自噬蛋白ULK1的泛素化來增強(qiáng)胃癌干細(xì)胞自噬，為胃癌的連床治療提供新的靶向治療方案。我們一起來學(xué)習(xí)一下這篇文章吧。

期刊：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

影響因子：12.658

發(fā)表年月：2022.11.14

材料：1例胃癌樣本，1例配對(duì)癌旁樣本

方法：10×Genomics scRNA-seq、普通轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、基因敲低與過表達(dá)

腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥的“種子細(xì)胞”。然而，不同來源的腫瘤干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記還未得到深入研究。胃癌作為全球第三大惡性腫瘤，患者預(yù)后往往較差。因此，針對(duì)胃癌腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物的研究對(duì)于腫瘤治療具有深遠(yuǎn)意義。

作者通過單細(xì)胞測(cè)序分析，繪制了胃腫瘤單細(xì)胞圖譜，并分析得到了腫瘤樣本中胃癌干細(xì)胞的特征基因AQP5。進(jìn)而通過基因過表達(dá)與敲低的體內(nèi)外模型構(gòu)建，一步步確證了AQP5與LGR5的共表達(dá)情況、兩者對(duì)腫瘤的協(xié)調(diào)促進(jìn)作用以及AQP5對(duì)自噬通路影響的分子機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)胃腫瘤的分子診斷以及靶向治療提供了新的思路。

Result1 胃腫瘤組織與配對(duì)癌旁組織的單細(xì)胞圖譜

為了挖掘胃癌腫瘤干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記，作者首先收集了一對(duì)臨床胃癌腫瘤樣本以及配對(duì)的癌旁組織，分別進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。經(jīng)過降維聚類以及細(xì)胞類型鑒定后，共鑒定到7個(gè)主要的細(xì)胞類型（圖1a），作者利用CD44、CD24、ALDH1A1等marker基因?qū)Ω杉?xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)分。為了進(jìn)一步探究胃癌腫瘤干細(xì)胞（GC-CSCs）與正常胃粘膜干細(xì)胞（GM-SCs）以及腫瘤上皮細(xì)胞之間的差異，挖掘其特異性表面標(biāo)記，作者分別比較了GC-CSCs與腫瘤上皮細(xì)胞，以及GC-CSCs與GM-SCs之間的差異基因（圖1 b、c），并通過venn取上調(diào)差異基因交集（圖1 d），最終獲得了5個(gè)候選基因(圖1 e)。

圖1 胃癌與對(duì)照樣本的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果

Result2 AQP5為胃癌干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記物且與預(yù)后不良高度相關(guān)

為了從五個(gè)候選基因中挑選最為顯著的標(biāo)志基因，作者進(jìn)一步對(duì)候選基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

首先，作者設(shè)置了流式分選實(shí)驗(yàn)，分別分選了GC-CSCs、GC上皮細(xì)胞與GM-SCs，并分別檢測(cè)了5個(gè)候選基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示AQP5在GC-CSCs中特異性表達(dá)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2 f），并且在后續(xù)的體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，AQP5同樣表現(xiàn)出胃癌干細(xì)胞的標(biāo)志特異性。

為進(jìn)一步探究AQP5對(duì)胃腫瘤疾病進(jìn)程的影響，作者通過mRNA定量、組織芯片以及生存分析，發(fā)現(xiàn)AQP5在胃腫瘤樣本中高表達(dá)，并且與不良預(yù)后高度相關(guān)（圖2 j-l）。

圖2. CDs可減弱輻射誘導(dǎo)的BMSCs損傷和衰老

Result3 過表達(dá)/敲低實(shí)驗(yàn)與異種移植共同驗(yàn)證AQP5的促腫瘤作用

為驗(yàn)證AQP5對(duì)胃腫瘤的影響，作者進(jìn)一步設(shè)計(jì)AQP5過表達(dá)與敲低實(shí)驗(yàn)，并且構(gòu)建了異種移植模型，結(jié)果顯示AQP5的過表達(dá)對(duì)胃腫瘤有顯著的促生長(zhǎng)作用（圖3）。

圖3 AQP5對(duì)胃腫瘤促進(jìn)作用的模型驗(yàn)證結(jié)果

Result4 AQP5與LGR5在胃癌干細(xì)胞中存在共表達(dá)趨勢(shì)且具有協(xié)同促腫瘤作用

進(jìn)一步探究AQP5與其他經(jīng)典腫瘤干細(xì)胞marker之間的相關(guān)性，作者通過TCGA數(shù)據(jù)分析，以及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方式，發(fā)現(xiàn)AQP5與LGR5存在共表達(dá)趨勢(shì)（圖4），進(jìn)一步證明AQP5作為胃癌干細(xì)胞特異性標(biāo)志物的可靠性。

圖4 AQP5與LGR5共表達(dá)趨勢(shì)的驗(yàn)證結(jié)果

隨后作者分別設(shè)計(jì)了AQP5與LGR5分別單獨(dú)敲低以及共同敲低體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)雙敲低組相比于單敲低組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用更加明顯（圖5），說明了AQP5與LGR5具有協(xié)同促腫瘤作用。

圖5 AQP5與LGR5單敲低與雙敲低的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Result5 AQP5通過介導(dǎo)自噬通路中ULK1的泛素化，進(jìn)而影響腫瘤生成

通過對(duì)AQP5過表達(dá)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組與蛋白組檢測(cè)，功能富集分析結(jié)果顯示干性相關(guān)通路并未發(fā)生顯著變化，因此作者參考AQP5同家族中AQP3對(duì)自噬通路的影響以及對(duì)腫瘤發(fā)展的促進(jìn)作用，對(duì)建立起AQP5通過影響自噬作用促進(jìn)腫瘤發(fā)生的假說。

隨后，作者通過一系列驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)AQP5的過表達(dá)與敲低對(duì)自噬通路確有影響（圖6）。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，AQP5通過介導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白ULK1的泛素化，進(jìn)而影響了腫瘤的生成(圖7)。

圖6 AQP5對(duì)自噬小體以及自噬相關(guān)蛋白的影響

圖7 AQP5對(duì)ULK1泛素化的影響

1.單細(xì)胞測(cè)序及分析繪制胃癌單細(xì)胞圖譜并挖掘胃腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物分子AQP5

2.流式分選、定量PCR以及生存分析聯(lián)合說明AQP5作為分子標(biāo)志物的潛力。

3.體內(nèi)外基因敲低與過表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證AQP5與LGR5的協(xié)同促腫瘤作用。

4.AQP5通過介導(dǎo)自噬通路相關(guān)蛋白泛素化，影響腫瘤發(fā)展。

5.本文有利于更好的理解腫瘤干細(xì)胞的分子機(jī)制，并為胃癌治療提供了新靶點(diǎn)。

【參考文獻(xiàn)】

Zhao, Rou, et al. "AQP5 complements LGR5 to determine the fates of gastric cancer stem cells through regulating ULK1 ubiquitination." Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 41.1 (2022): 322.

DOI：https://doi.org/10.1186/s13046-022-02532-w