看完啦！

老師舉例能力賊牛批，通俗易懂，便于俺們小白理解！

干貨很多，可以幫助我們盡快對(duì)生信分析即將涉及到的內(nèi)容有大致印象，部分細(xì)節(jié)自行進(jìn)行了補(bǔ)充。

1 測(cè)序原理

見(jiàn) notion

2 大片段文庫(kù)

大片段文庫(kù)：pairend（文庫(kù)片段大于1k的片段）

小片段文庫(kù)：matepair（文庫(kù)片段小于1k的片段）

• 無(wú)論片段有多大，雙末端測(cè)序只能測(cè)兩端很短的部分（小幾百bp）

大片段測(cè)序

目的：獲得reads之間的物理距離關(guān)系（在序列拼接和基因組結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)中有重要作用）。

面臨問(wèn)題：

1. 無(wú)法PCR太長(zhǎng)的片段
2. 只測(cè)序很短的序列，合成大片段浪費(fèi)

解決方案：環(huán)化處理，進(jìn)行打斷，選取生物素標(biāo)記片段（包含首尾），接下來(lái)的過(guò)程與小片段處理完全一致。

3 測(cè)序原理

GCbias對(duì)測(cè)序的影響：

會(huì)影響PCR

GC正常范圍：35%~65%

解決方案：PCR-free文庫(kù)（詳見(jiàn)notion or 公眾號(hào)）

why不能一直測(cè)序下去？

后期錯(cuò)誤率顯著增加，隨著反應(yīng)進(jìn)行，酶活性下降，反應(yīng)條件發(fā)生較大改變，更重要的是phasing和pre-phasing，會(huì)對(duì)整體信號(hào)造成干擾。

測(cè)序中注意問(wèn)題：

1. 必須保證DNA質(zhì)量，不能降解
2. 樣品量要滿足建庫(kù)要求
3. 要根據(jù)具體樣品特點(diǎn)選擇合適的建庫(kù)測(cè)序策略
4. 測(cè)序要飽和（詳見(jiàn)下節(jié)）

# 生信相關(guān)文件格式介紹詳見(jiàn)notion or 公眾號(hào)，eg. fastq, sam, bam and so on

4 測(cè)序飽和度評(píng)估

測(cè)序不飽和的影響：

1. 對(duì)于DNA基因組測(cè)序來(lái)說(shuō)，影響序列拼接
2. RNAseq定量不準(zhǔn)
3. 宏基因組不能準(zhǔn)確反映物種的組成

5 數(shù)據(jù)質(zhì)控

指標(biāo)：

堿基含量分布（測(cè)序數(shù)據(jù)與基因組GC含量一致）

堿基質(zhì)量分布（eg. 質(zhì)量值>Q20為好堿基，Q20百分比指質(zhì)量值大于等于20的堿基占總堿基的比例。注：Q值是描述單個(gè)堿基，Q20百分比是描述整體堿基）

# 生信相關(guān)軟件使用及其算法詳見(jiàn)notion or 公眾號(hào)

6 測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾

去除哪些嘞：

1. 非“基因組”本身序列（adapter接頭、測(cè)序引物、barcode、index等）
2. N堿基過(guò)多的reads
3. 低質(zhì)量的數(shù)據(jù)（eg. 低于Q20堿基占一條reads總堿基的比率）
4. duplication（打斷不隨機(jī)造成的）
5. insertsize偏差過(guò)大的reads（可選）

注：

1. RNAseq與16S測(cè)序的duplication并不是打斷不隨機(jī)造成
2. 去除duplication會(huì)造成豐度信息丟失

7 短序列比對(duì)

短序列比對(duì)就是將這些測(cè)序的reads重新定位到基因組上，這個(gè)過(guò)程也叫做回帖或者mapping。

比對(duì)情況：

5 reads比對(duì)不到基因組上（0VS0）

8 短序列比對(duì)作用

兩種情況：

1. 與自身基因組比對(duì)
2. 計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)覆蓋深度
3. 計(jì)算參考序列覆蓋比率
4. 與參考基因組比對(duì)
5. RNA測(cè)序計(jì)算基因表達(dá)量
6. 宏基因組測(cè)序計(jì)算不同生物的豐度
7. 變異檢測(cè)

作用

1. 計(jì)算reads利用率：reads利用率=比對(duì)到目標(biāo)序列的reads數(shù) / 總reads數(shù)
2. 計(jì)算覆蓋深度與覆蓋比率
3. 覆蓋深度，coverage depth，也稱為覆蓋度，也叫乘數(shù)，是指每個(gè)堿基被測(cè)序的平均次數(shù)，是用來(lái)衡量測(cè)序量的首要參數(shù)。
4. 覆蓋比率，coverage ratio，也稱覆蓋率，指被測(cè)序到的堿基占全基因組大小的比例。覆蓋比率可以用來(lái)計(jì)算親緣關(guān)系。

測(cè)序覆蓋度與物理覆蓋度：

短序列比對(duì)軟件介紹了很多個(gè)，以后可深入學(xué)習(xí)，不過(guò)是不是只需要了解常用的即可嘞~

9 估計(jì)insertsize

插入片段insertsize大小，也就是文庫(kù)片段的長(zhǎng)度，同樣也是兩條測(cè)序reads的物理距離。

（insertsize大小包括reads長(zhǎng)度）

10 計(jì)算RNAseq基因差異表達(dá)分析

RPKM：

但是可變剪切reads有時(shí)候無(wú)法比對(duì)回去

So，

現(xiàn)在改用TPM了，相較于前兩者計(jì)算結(jié)果更準(zhǔn)確。

比較基因的差異表達(dá)：

1. FC值
2. FDR校正

11 變異檢測(cè)

處理有歧義的位點(diǎn)：

1. 質(zhì)量值小于Q20
2. 落在重復(fù)區(qū)域的位點(diǎn)
3. 低頻的位點(diǎn)
4. 利用概率模型進(jìn)行過(guò)濾

12 物種組成與豐度計(jì)算

16S高變區(qū)測(cè)序

1. 數(shù)據(jù)過(guò)濾（注：這里數(shù)據(jù)過(guò)濾不可以去除duplication）
2. reads拼接為tags
3. tags聚成OTU（operational taxonomic unit）（可用mothur工具）
4. OTU進(jìn)行分類
5. OTU物種分類
6. 得到物種組成及豐度

13 短序列比對(duì)FAQ

建立索引錯(cuò)誤：

1. 目標(biāo)序列不能太短，否則無(wú)法建立索引
2. 序列文件中不要有回車符
3. 選擇正確的 bwa index 選項(xiàng)

短序列比對(duì)的資源消耗：

使用bam來(lái)減少數(shù)據(jù)存儲(chǔ)

如何提高比對(duì)效率：

1. 完善軟件算法
2. 提高計(jì)算機(jī)硬件資源
3. 比對(duì)前要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理
4. 將數(shù)據(jù)拆分合并提高比對(duì)效率

短序列比對(duì)與長(zhǎng)序列比對(duì)差別：

1. 長(zhǎng)序列是比對(duì)多少的問(wèn)題，短序列是比對(duì)有無(wú)的問(wèn)題
2. 長(zhǎng)序列可以允許更多的gap和錯(cuò)配
3. 親緣關(guān)系太遠(yuǎn)，無(wú)法使用短序列比對(duì)，結(jié)果不好

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我是手動(dòng)分割線嘿嘿嘿

14 序列拼接簡(jiǎn)介

序列拼接是生物信息分析的核心

測(cè)序reads——序列拼接軟件——拼接結(jié)果

序列拼接存在問(wèn)題：

1. 兩條序列的方向
2. overlap的大小
3. overlap之間存在錯(cuò)配
4. 一條序列與多條序列之間存在overlap
5. 連接之后是否可以繼續(xù)連接

相關(guān)名詞：reads, pairend與matepair, insertsize, kmer, contig, scaffold...更多生信相關(guān)名詞解釋見(jiàn) notion or 公眾號(hào)

15 序列拼接（未理解透徹，后期需深入了解）

序列拼接可用數(shù)據(jù)：

1. 兩條pairend關(guān)系reads
2. reads之間具有overlap
3. reads之間具有pairend關(guān)系

序列拼接兩種算法：

1. Overlap-layout-consensus（popular for Sanger reads）
2. De bruijn graph（popular for illumina and Solid reads）

短序列拼接步驟：

1. 構(gòu)圖pregraph
2. 構(gòu)建contig
3. 構(gòu)建scaffold（包括map）
4. 補(bǔ)洞

詳見(jiàn)其他......

序列拼接軟件：

SOAPdenovo

velvet

SPAdes

Newbler

16 基因組污染分析

基因組污染特征：

1. 基因組明顯偏大
2. 序列豐度不同
3. GC異常

序列唯一性：序列越長(zhǎng)唯一性越高

污染鑒定：

1. 與NCBI比對(duì)進(jìn)行鑒定
2. 預(yù)測(cè)16S（或18S）進(jìn)行鑒定

污染處理：

由于序列之間存在相似性，豐度存在交叉，無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分開(kāi)污染序列與正常序列。故建議，重新提取樣品進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。

17 RNAseq與meta序列拼接

DNA測(cè)序與RNAseq比較：

1. DNA一般為全基因組測(cè)序，而RNA測(cè)序的是轉(zhuǎn)錄出來(lái)的轉(zhuǎn)錄本，都是獨(dú)立斷開(kāi)的片段；
2. DNA測(cè)序一般是均勻測(cè)序，基因組上的區(qū)域被均勻覆蓋，而RNA由于存在表達(dá)豐度的差異，所以不均勻；
3. DNA全基因組測(cè)序中存在很多重復(fù)序列、干擾序列的拼接，而轉(zhuǎn)錄組中這個(gè)問(wèn)題影響會(huì)小一些。

RNA序列拼接軟件：

Trinity

oases

SOAPdenovo-trans

RNA拼接注意事項(xiàng)：

1. 拼接結(jié)果中獲取unigene
2. 拼接時(shí)要去除duplication
3. 表達(dá)定量時(shí)不能去除duplication

宏基因組拼接：

宏基因組（metagenome），也稱微生物環(huán)境基因組或元基因組。

18 序列拼接FAQ

影響拼接的因素：

內(nèi)因：多倍體，基因組雜合，高度重復(fù)，低復(fù)雜度，GC偏差等

外因：測(cè)序數(shù)據(jù)量，測(cè)序質(zhì)量，文庫(kù)大小，kmer大小，基因組自身，拼接軟件，閾值設(shè)定

如何改善拼接效果：

1. 覆蓋基因組所有位點(diǎn)
2. 重新調(diào)整insertsize
3. 去除insertsize偏大的pairend?reads
4. 調(diào)整kmer大小以及軟件選項(xiàng)參數(shù)閾值
5. 混合拼接

不同測(cè)序平臺(tái)之間測(cè)序數(shù)據(jù)混合拼接：

為什么不用短reads直接overlap拼接：

1. reads中存在錯(cuò)誤率
2. 通過(guò)kmer去除包含reads中錯(cuò)誤的位點(diǎn)

如何選擇kmer大小（軟件也不知道哈哈哈哈）：

1. reads準(zhǔn)確度越高，選擇大kmer較好
2. reads錯(cuò)誤率高，選擇小kmer，reads利用率高
3. 基因組本身特點(diǎn)，重復(fù)率，測(cè)序深度等因素，都會(huì)對(duì)kmer取值造成一定影響

為什么kmer只能是奇數(shù)：

主要是回文序列的影響，取偶數(shù)無(wú)法區(qū)分互補(bǔ)鏈和模板鏈

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基因組分析開(kāi)始啦！

19 基因預(yù)測(cè)

基因預(yù)測(cè)方法：

1. 利用軟件對(duì)物種基因組直接進(jìn)行預(yù)測(cè)；
2. 通過(guò)同源序列比對(duì)，和已知近源物種基因及進(jìn)行比對(duì)，將同源比對(duì)去篩選出來(lái)作為基因。

方法比較：

1. 從頭預(yù)測(cè)：不需要同源參考基因序列直接進(jìn)行預(yù)測(cè)，非常方便，適合于新發(fā)現(xiàn)的物種，沒(méi)有很多已知的基因信息。
2. 基于同源基因的序列比對(duì)：找出的基因更加準(zhǔn)確，但是如果沒(méi)有同源序列，或者同源區(qū)不含有某個(gè)基因的話，就會(huì)漏掉一些基因。

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后續(xù)講解均為概況，僅適用于粗略了解，可依據(jù)自身需求進(jìn)行深入學(xué)習(xí)。

20 基因功能注釋

ENCODE計(jì)劃

21 非編碼RNA分析

22 miRNA分析

23 重復(fù)序列分析

24 基因組特殊元件分析

CRISPR，CpG島，操縱子，基因島，啟動(dòng)子

25 共線性分析

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序列比對(duì)、變異檢測(cè)，需深入學(xué)習(xí)！

26 變異檢測(cè)

Denovo測(cè)序：如果一個(gè)基因組第一次被測(cè)序出來(lái)，我們一般稱之為Denovo測(cè)序，主要是需要拼接其基因組。

重測(cè)序：已有基因組被發(fā)表出來(lái)后，重新測(cè)序的數(shù)據(jù)，可以不需要拼接，而直接用測(cè)序的reads進(jìn)行短序列短序列比對(duì)分析，稱為重測(cè)序分析，即文獻(xiàn)中經(jīng)常見(jiàn)到的“re-sequencing”，其實(shí)重測(cè)序本質(zhì)就是找變異。

26 SNP檢測(cè)

27 SV檢測(cè)

28 CorePanGene集構(gòu)建

29 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

數(shù)據(jù)上傳！我一定會(huì)盡快用到的！

課程涉及知識(shí)點(diǎn)如果和自己研究方向相關(guān)性較大，建議去看更詳細(xì)的教程進(jìn)行針對(duì)性學(xué)習(xí)。

加油！

祝我們?cè)缛彰摬耍。。?/p>