外源蛋白在宿主細胞中表達純化常常會遇到很多瓶頸問題

例如：

• 如何進行表達的監(jiān)測篩選？

• 可溶性表達水平低？

• 不穩(wěn)定易水解？

• 以及蛋白質的翻譯后修飾等問題

將多肽或蛋白質作為標簽，與目標蛋白共表達的方法很大程度地解決了以上問題

標簽蛋白主要分為兩類：一類為自發(fā)熒光標簽，它們主要應用于目標蛋白表達代謝的動態(tài)監(jiān)測，另一類就是主要輔助蛋白質分離純化的親和吸附標簽。本期盤點的內容主要針對親和吸附標簽。

親和吸附標簽不僅便于對融合蛋白的檢測與純化，而且可能對目標蛋白的理化性質產(chǎn)生有利的影響：可以提高重組蛋白的產(chǎn)量，增強重組蛋白的可溶性，促進重組蛋白的正確折疊。

常用親和吸附標簽蛋白

His

His標簽被認為是蛋白純化的首選標簽，它由六個組氨酸殘基（HHHHHH）組成，分子量極小只有~0.84KD，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。His標簽融合蛋白的純化是借助于層析介質上的過渡金屬離子（如Cu、Zn2+、Ni2+、Co等）與His融合蛋白上的His標簽的配位作用實現(xiàn)目標蛋白的分離。

N-端的His標簽與細菌的轉錄翻譯機制兼容，有利于蛋白表達；His標簽很小，幾乎不影響目標蛋白的理化性質及其可溶性，在目標蛋白結晶后對其蛋白結構幾乎沒有影響；并且其免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動物進行抗體制備。

然而，并不是所有的蛋白質都可以與His標簽融合后，采用固定化金屬離子親和層析分離純化。宿主蛋白中含有半胱氨酸及天然發(fā)生的組氨酸豐富區(qū)域，在固定化金屬離子親和層析時可能會導致其他蛋白的非特異性結合; 目標蛋白含有金屬離子，一般也不采用His標簽與固定化金屬離子親和層析。

FLAG

FLAG 標簽是由8個氨基酸( DYKDDDDK) 組成的一個短肽，分子量很小，因而不會遮蓋融合蛋白中其他的蛋白表位與結構域，也不會改變融合蛋白的功能、分泌或運輸。目的蛋白N端融合了Flag多肽后，C末端還可以融合其他模塊或者不同的親和配體。

在FLAG標簽的基礎上，將3個FLAG 標簽串聯(lián)在一起，便形成了一個由 22 個氨基酸組成的3 × FLAG 標簽。與原始FLAG標簽相似，3 × FLAG標簽的分子量很小，只有2.7 kDa，天然親水，因而不會改變融合蛋白的功能，且同時含有一個腸激酶切割位點，便于除去標簽。更為重要的是，該標簽具有更高的檢測敏感性，特別適合于哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中低表達水平蛋白質的檢測。而對于某些需要維持生物活性的小分子目標蛋白，在其免疫沉淀純化中，結合一個高效接頭結構的3 × FLAG 標簽表現(xiàn)出更顯著的純化效果。

GST

GST 標簽由 211 個氨基酸組成，大小約為26kDa，廣泛用于重組蛋白融合表達與親和純

化。GST 標簽可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達，起到提高表達量的作用；GST可在一定程度上增大融合蛋白的可溶性，不僅促進了目標蛋白的正確折疊，提高了蛋白產(chǎn)量，而且有助于后續(xù)的蛋白純化；GST標簽可很好的保留融合蛋白的抗原性和生物活性，并可使用不同的蛋白酶方便去除。但GST易于同源二聚化，從而增加純化難度，且相對短肽標簽，分子量較大，在融合表達時可能會影響蛋白功能，并增加細胞代謝負擔。

c-Myc

c-Myc標簽蛋白（EQKLISEEDL），其大小為1.2kDa，它作為抗原表位表達在不同的蛋白質框架中可識別其相應的抗體。c-Myc標簽常應用于WB、免疫沉淀和細胞流式術中，可用于檢測重組蛋白質在靶細胞中的表達。但需要注意的是Myc標簽蛋白本身即為人的Myc基因的一部分，所以應盡量避免將該蛋白應用于人的細胞或組織相關實驗。

HA

HA標簽（氨基酸序列：YPYDVPDYA）是?段來源于?流感病毒?凝素（HA）蛋?第 98～

106 位氨基酸的短序列，分?量為1.1 KDa，是?前?泛應?的表位標簽之?，能形成強烈的抗體識別位點。通過分??物學?段將HA標簽融合到?的蛋?的C端或N端后，抗 HA 標簽抗體可?于HA標記的靶蛋?的檢測、分離和純化，??需蛋?特異性抗體或探針。HA對外源蛋白的空間結構影響小，容易構建成標簽蛋白融合到C端或者N端。

如何選擇合適的親和吸附標簽？通常需要注意以下3點：

① 根據(jù)實驗目的選擇合適的標簽，例如蛋白純化選擇His標簽，WB通常選擇FLAG

② 確定標簽蛋白對目的蛋白的表達是否產(chǎn)生干擾、

③ 確定標簽蛋白標記的位置是在目的蛋白的N端還是C端。