骨骼的形成是一個復(fù)雜而精密的生物學(xué)過程。在這一過程中，礦物質(zhì)被轉(zhuǎn)運和整合到膠原蛋白基質(zhì)中形成具有特殊結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，從而實現(xiàn)骨的機械、生物和化學(xué)功能。骨的礦化需要轉(zhuǎn)運和積累大量的鈣離子在礦化部位，但鈣離子作為細(xì)胞間通訊重要的信使，需要在細(xì)胞質(zhì)中始終維持較低濃度以保證通訊的靈敏性，高等動物骨骼發(fā)育過程中協(xié)調(diào)二者矛盾的機制，目前仍未被闡明。

雞胚由于具有骨形成速度快，骨骼體積較小能進(jìn)行高分辨成像等優(yōu)勢，是科學(xué)家們研究骨礦化過程的良好生物模型。一只剛出殼的雛雞體重約為38g（骨骼質(zhì)量約8.1g），其體內(nèi)的鈣離子總量約為0.15g（3.5mmol）。鈣離子從蛋殼運輸?shù)诫u胚骨骼生長部位主要依賴血清，孵化時雛雞血清中鈣離子濃度為2.55mM，由此可以計算出，雛雞骨骼礦化過程需要約1.45L血清（其體積如圖1立方體所示），這是小雞孵化時骨骼體積的340倍，遠(yuǎn)超雞胚所含血清體積。因此， 研究鈣離子以低濃度在血清中轉(zhuǎn)運，并在骨形成部位富集的過程，是解決上述問題的關(guān)鍵。

由前人的研究可知，在雞胚中，游離的鈣離子主要來自蛋殼，由高度血管化的絨毛膜運輸?shù)襟w內(nèi)。當(dāng)鈣離子被轉(zhuǎn)運到血清中時，主要由鈣結(jié)合蛋白，特別是Fetuin-A，負(fù)責(zé)鈣離子的轉(zhuǎn)運。但鈣離子離開循環(huán)系統(tǒng)后，在骨形成部位（如新形成的膠原樣骨）的細(xì)胞和組織中富集和釋放過程目前仍不清楚。為了保證鈣離子介導(dǎo)的細(xì)胞通訊的正常進(jìn)行，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)通常需要維持極低的鈣離子濃度（約為100nM，小于血清中鈣濃度2.55mM），因此，大量鈣離子被儲存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器中，并在需要的時候通過離子通道釋放。在成骨細(xì)胞中，鈣離子的存儲和運輸更為重要，因為它需要運輸大量鈣離子以滿足骨礦化需求，但鈣離子等礦物在骨細(xì)胞內(nèi)的運輸機制仍未被闡明。

為了解釋這一問題，科學(xué)家們需要對被運輸?shù)牡V物前體進(jìn)行大尺度的高分辨成像，以觀察礦物前體從成骨細(xì)胞中運輸?shù)降V化部位的動態(tài)變化。 本文的研究者選用發(fā)育中的雞胚作為研究對象，使用X射線斷層掃描和冷凍FIB-SEM成像技術(shù)，對雞胚的股骨進(jìn)行高分辨率的三維成像，用以在接近自然狀態(tài)的條件下觀察和量化分析礦物前體在成骨細(xì)胞和礦化骨基質(zhì)中的轉(zhuǎn)運和沉積過程。本文中的圖像分析和三維渲染均使用ORS Dragonfly軟件完成。

首先，為了評估雞胚骨礦化的進(jìn)程，研究者們使用micro-CT對受精后（胚胎發(fā)育日，EDD）13天和14天的雞胚進(jìn)行成像（圖2A,B），并劃定股骨中心部位厚度1mm的區(qū)域為ROI進(jìn)行后續(xù)分析。通過使用ORS Dragonfly軟件對X射線成像數(shù)據(jù)進(jìn)行閾值分割， 研究者們分別計算出EDD13和EDD14中ROI的礦化骨骼體積。結(jié)果表明，在EDD13到EDD14的一天時間內(nèi)，股骨礦化體積從0.155mm3增加到0.268mm3，增長了73%。觀察EDD13時股骨橫斷面背散射（BSE）圖像（圖2C）可以發(fā)現(xiàn)，股骨最內(nèi)側(cè)骨領(lǐng)更亮，即礦化程度更高，且沿著向骨膜側(cè)方向，礦物密度逐漸降低，尤其在優(yōu)先生長方向上降低更明顯.蘇木精和伊紅染色（圖2D,E）顯示骨膜層富含成骨細(xì)胞。

為了進(jìn)一步觀察雞胚中成骨細(xì)胞到骨膜的礦化物質(zhì)流，研究者們使用聚焦離子束掃描電子顯微鏡（FIB-SEM）層析成像對處于EDD13的三個不同標(biāo)本的股骨中段進(jìn)行成像，并對其中骨生長最活躍的部位——最外層骨小梁進(jìn)行分析。圖3顯示了兩種不同探測器對被礦化基質(zhì)包圍的骨細(xì)胞的成像結(jié)果。Inlens/SE混合檢測器通過檢測局部表面電位差成像，而BSE檢測器通過記錄材料中電子密度差異成像。圖3A, B分別顯示了一個嵌入礦化膠原蛋白基質(zhì)和未嵌入基質(zhì)的成骨細(xì)胞的Inlens/SE圖像。在細(xì)胞內(nèi)可以觀察到囊泡結(jié)構(gòu)。這些囊泡包含平均直徑為80nm的顆粒結(jié)構(gòu)（圖3 A-B箭頭）。當(dāng)用BSE探測器觀察時，研究者們發(fā)現(xiàn)這些顆粒含電子致密物質(zhì)（圖3C, D 箭頭所指的亮點），即囊泡轉(zhuǎn)運的礦物前體。有趣的是，并非所有Inlens/SE觀察到的顆粒在BSE圖像中都為致密顆粒。

此外，由圖4可以看出，許多囊泡不含致密顆粒（黃色），即Inlens/SE圖像所示的囊泡中沒有顆粒結(jié)構(gòu)，BSE圖像中也未發(fā)現(xiàn)致密顆粒（亮斑）。因此在后續(xù)的分析中，研究者們只對含致密顆粒，即包含礦物前體的囊泡進(jìn)行分析。

研究者們接下來使用ORS Dragonfly軟件對三個樣品中含有礦物前體的囊泡進(jìn)行了分割。首先，他們使用slice registration 菜單中的SSD（sum of square difference）方法對同一樣品的BSE數(shù)據(jù)集和Inlens/SE數(shù)據(jù)集進(jìn)行了自動配準(zhǔn)。為了提高圖像質(zhì)量，研究者們接下來構(gòu)建了一個卷積濾波器用于增加對比度和降噪，并對Inlens/SE數(shù)據(jù)集額外增加了一個CLAHE濾波器，進(jìn)一步提高圖像對比度。為了準(zhǔn)確分割FIB-SEM圖像中的不同組分，研究者們接下來使用了深度學(xué)習(xí)模塊，分別基于BSE數(shù)據(jù)集和Inlens/SE數(shù)據(jù)集訓(xùn)練了深度學(xué)習(xí)模型，用于分割致密顆粒、骨基質(zhì)、囊泡、細(xì)胞核等組分。每個模型各使用20張人工標(biāo)記的切片進(jìn)行訓(xùn)練。

基于深度學(xué)習(xí)模型的分割結(jié)果，研究者們在三個樣品中共找到432個含礦物前體的囊泡，它們的平均體積為0.65um3，且80%的囊泡體積小于1um3（圖5A）。此外，研究者們還發(fā)現(xiàn)囊泡的體積與囊泡內(nèi)礦物前體的含量成正相關(guān)（圖5B）。三組樣品的填充因子（囊泡內(nèi)礦物前體的體積/該囊泡體積）均值約為9%（圖5C）。

圖6展示了樣品2分割后的三維渲染圖。在這個ROI中可以觀察到含礦物前體的囊泡集中分布在礦化骨基質(zhì)周圍（圖6A），且這些囊泡都位于骨細(xì)胞內(nèi)（圖6B），未觀察到胞外囊泡。

研究者們共對三個樣品中6-7個有細(xì)胞核的骨細(xì)胞進(jìn)行了部分成像。這些細(xì)胞的空間位置不同，嵌入礦化基質(zhì)的程度也不同。隨著從成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞分化，嵌入程度加深，這些細(xì)胞的胞質(zhì)逐漸延伸，形成特殊的管腔（圖6B，紅色）。為了研究礦化基質(zhì)中這些小管網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和功能，研究者們觀察并分析了樣品電鏡圖像中礦化骨基質(zhì)部分區(qū)域，如圖7所示。

?圖7展示了樣品2骨基質(zhì)部分的電鏡掃描圖和含骨基質(zhì)內(nèi)小管的3D渲染圖。由于胚胎骨是編織結(jié)構(gòu)，其中的膠原散亂排布，因此在圖7A中，只有部分區(qū)域能觀察到膠原纖維特有的67nm D -帶。除此之外，還在骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了未礦化的膠原纖維（黑色箭頭所指區(qū)域）。在Inlens/SE通道的圖像中，研究者們還發(fā)現(xiàn)了直徑約為300nm的管狀結(jié)構(gòu)（圖7A,B，藍(lán)色箭頭）。BSE通道圖像顯示，藍(lán)色箭頭所指的小管和白色箭頭所指的納米通道均襯度較低，表明這兩種結(jié)構(gòu)的礦化程度較低。其中較粗的結(jié)構(gòu)明確的對應(yīng)為小管，因為他們與礦化基質(zhì)內(nèi)的骨細(xì)胞相連。而白色箭頭所指的結(jié)構(gòu)在膠原纖維之間形成了一個納米通道網(wǎng)絡(luò)，這一通道系統(tǒng)占了的骨基質(zhì)總體積的14%，并且直接與300nm的小管相連。

綜上，本文的作者們提出了一個基于胞內(nèi)囊泡主動運輸?shù)墓堑V化分層模型（圖8）。鈣離子等礦化前體物質(zhì)首先通過主動運輸被儲存在骨細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中，并在其中富集，形成富含礦物前體的囊泡。這些囊泡在細(xì)胞內(nèi)被高速轉(zhuǎn)運到骨形成部位，并通過胞吐作用被釋放到骨基質(zhì)中。其中的礦物前體通過納米通道網(wǎng)絡(luò)在骨基質(zhì)中被動擴散，以達(dá)到礦化點位。在本文的模擬計算中，囊泡的運輸效率足以完成雞胚骨骼礦化任務(wù)。但由于本文中只考慮了含致密顆粒的囊泡，未考慮低電子密度的前體物質(zhì)和可能不通過囊泡運輸參與礦化的其他前體物質(zhì)，因此估算的準(zhǔn)確度仍有不足，需要結(jié)合其他研究方法進(jìn)行補充完善。

本文靈活運用ORS Dragonfly軟件，在多個不同來源（Micro-CT、FIB-SEM）的圖像數(shù)據(jù)集上實現(xiàn)了圖像配準(zhǔn)，圖像增強，降噪，基于閾值/深度學(xué)習(xí)模型的圖像分割以及圖像特征統(tǒng)計分析等功能， 值得大家參考學(xué)習(xí)。

參考資料

Raguin, E.,?Weinkamer, R.,?Schmitt, C.,?Curcuraci, L.,?Fratzl, P.,?Logistics of Bone Mineralization in the Chick Embryo Studied by 3D Cryo FIB-SEM Imaging.?Adv. Sci.?2023, 2301231.?https://doi.org/10.1002/advs.202301231

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