寫在前面

????????今天推薦的是由西班牙國家癌癥研究中心團隊在2016年3月7日發(fā)表于Nature Structural & Molecular Biology （IF：12.474，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Oscar Fernandez-Capetillo教授，研究表明USP7是SUMO去泛素酶，對DNA復制至關重要。

研究背景

????????泛素（Ub）和類泛素對蛋白質的翻譯后修飾，可用于調節(jié)DNA復制。復制子周圍的染色質富含SUMO，而Ub較少，而成熟的染色質則呈現(xiàn)相反的模式。?如何在哺乳動物細胞中的DNA復制位點附近維持這種高SUMO，低Ub環(huán)境的方法尚待探索。在這里，作者將USP7鑒定為富含復制體的SUMO去泛素酶，這對DNA復制至關重要。

摘要部分

????????USP7通過作用于SUMO和SUMO?；牡鞍踪|抵消了它們的泛素化作用。USP7的抑制或基因缺失導致Ub在SUMOylated蛋白上積累，而SUMOylated蛋白則遠離復制體。?作者的發(fā)現(xiàn)提供了一個模型，該模型解釋了復制叉處SUMO和Ub的差異積累，并確定了USP7在DNA復制中的重要作用，這些作用在開發(fā)USP7抑制劑作為抗癌劑時可作為參考。

研究內容

1.USP7活性對于DNA復制至關重要? ???

????????為了確定復制體周圍USP的相對豐度，作者進行了iPOND實驗，并與絕對和相對定量的等價標簽（iTRAQ）相結合，評估了它們在新生和成熟染色質中的存在。蛋白質組學分析顯示，USP7與MCM復合體成員之間存在相互作用。作者發(fā)現(xiàn)，USP7免疫沉淀回收了MCM4，并且這種相互作用不受USP7抑制作用的影響。并通過其他數(shù)據(jù)表明，USP7是復制體相關的USP。

????????接下來，作者尋求通過使用特異性抑制劑P22077探索USP7在DNA復制中的功能。用高通量顯微鏡（HTM）測量， P22077處理HCT116細胞導致5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）摻入的劑量依賴性降低以及磷酸化組蛋白H2AX（γH2AX）的增加。這些數(shù)據(jù)表明USP7抑制復制。與該結論一致，用P22077治療導致PCNA單泛素化和隨后的CHK1磷酸化。

研究結論：USP7存在于復制體附近，并且其活性是維持活性DNA復制并防止獨立于PCNA泛素化或p53的復制壓力所必需的。

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2.USP7調節(jié)前叉前進和原點射擊

????????為了了解USP7如何調節(jié)DNA復制，作者分析了復制叉進展和拉伸的DNA纖維中的起源活動。用三種不同的USP7抑制劑處理，導致正在進行的復制叉的速度大大下降。降低復制叉速度，如腫瘤基因的過度表達或暴露于基因毒性藥物，會導致額外的 "休眠 "起源的激活作為補償。相反，用三種藥物中的任何一種抑制USP7，不僅降低了復制叉的速度，而且還減少了新起源的啟動。USP7的表達明顯反作用于對P22077的復制叉的降低，從而進一步支持抑制劑在DNA復制中的作用是由USP7引起的。

研究結論：USP7的活性促進了人類細胞的起源發(fā)射和復制叉的進展。

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3.蛋白質組學分析確定SUMO為USP7靶標

????????為了研究USP7如何調控DNA復制，作者在染色質上尋找這個DUB的新底物。作者使用了最近開發(fā)的方法，該方法以免疫沉淀泛素化的肽為基礎，用一種抗體識別泛素分子胰酶消化后留下的二甘氨酸殘余（二甘氨酸法）。通過該方法作者確定了一個包含泛素化肽的區(qū)域，該區(qū)域在兩個獨立的實驗中被USP7抑制后被富集。正如預期的那樣，這個區(qū)域包括幾個已知的USP7的目標。在作者的iPOND實驗中，USP1，也富集在復制體上。此外， USP1的抑制強烈地增加了PCNA K164泛素化，而對大多數(shù)已知的USP7底物沒有影響。是另一方面，在USP1抑制后，SUMO2上對P22077泛素化增加的賴氨酸沒有一個被泛素化。

研究結論：抑制USP7對SUMO2的影響是選擇性的，而不是染色質中存在的USP的一般影響。

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4.USP7在體內和體外使SUMO去泛素化

????????接下來，作者評估了USP7是否能夠在體外使SUMO2鏈去泛素化。作者將泛素化的聚SUMO2與重組USP7或USP1和UAF1一起孵育，并通過蛋白質印跡（WB）分析了反應的產(chǎn)物。如前所述，His-RNF4優(yōu)先對長的多聚SUMO2鏈進行泛素化，但也催化由三到五個SUMO2分子組成的多聚SUMO鏈的單泛素化。不僅如此，作者通過MS確認了泛素化的SUMO2條帶，該條帶確定了SUMO2肽含有胰蛋白酶消化后產(chǎn)生的二甘醇泛素殘余。此外，在體外經(jīng)歷USP7依賴性去泛素化的SUMO2的一些賴氨酸與體內USP7抑制后表現(xiàn)出增加泛素化的賴氨酸相一致（K11和K33）。與USP7孵化，而不是USP1，也減少了這些高度泛素化的物種的大小，從而表明USP7可以針對單泛素化和多泛素化SUMO2鏈。與這一結論相一致，重組的USP7（和USP1）可以裂解K48和K63多泛素鏈。因此，作者的結果證實，USP7是一種SUMO2脫泛素酶，可以從SUMO2鏈上去除單泛素和多泛素。最后，為了確定USP7是否也在體內對SUMO2進行去泛素化，作者通過免疫熒光（IF）測量染色質結合的SUMO2和SUMO3（SUMO2/3）的水平，發(fā)現(xiàn)在USP7抑制后，染色質結合的SUMO2/3有所增加且USP7的作用僅限于染色質。雖然在細胞膜中沒有檢測到變化，但觀察到在USP7抑制后，SUMO2/3修飾的蛋白質在核可溶性部分，特別是染色質部分的積累。為了確定USP7抑制后積累的SUMO2/3修飾的蛋白質是否也被泛素化，作者用Ni-NTA樹脂免疫沉淀泛素化的蛋白質后，測量了input和pulldown的SUMO化蛋白質的水平。正如預期的那樣，用MG132抑制蛋白酶體導致input的SUMO化蛋白大量積累，而對USP7的抑制則影響較小。在抑制蛋白酶體或USP7后，SUMO化和泛素化的蛋白質都有強烈的增加。

研究結論：USP7是一個SDUB，它的抑制導致染色質結合的SUMO化蛋白的積累，這些蛋白也被泛素化。

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5.segregase p97與USP7共同作用于染色質? ? ??

????????雖然泛素化通常針對蛋白質進行降解，但作者觀察到，USP7的抑制導致泛素化蛋白質在染色質上的積累。最近的證據(jù)表明，為了使染色質上的泛素化蛋白被降解，它們首先需要被p97分離酶提取。因此，因此作者分析了p97的抑制是否會進一步增加染色質上的SUMO化和泛素化蛋白的積累。將HCT116細胞暴露于p97抑制劑NMS873并不影響SUMO化蛋白的水平。相反，USP7的抑制增加了染色質上SUMO化和泛素化蛋白的水平，USP7和p97的聯(lián)合抑制加強了這種積累。這些數(shù)據(jù)共同表明，USP7針對復制體上的SUMO化蛋白并限制其泛素化。然后泛素化的因子成為p97的底物，p97隨后將它們從染色質中提取。

研究結論：USP7通過限制泛素化和隨后被p97分離酶提取，促進了復制體周圍SUMO化蛋白的集中。

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6.USP7抑制作用降低了復制子上的SUMO豐度

????????如上所述，使用iPOND，作者發(fā)現(xiàn)復制體周圍的染色質富含SUMO23。以前的研究表明，SUMO2/3在S期與PCNA共定位。因此，作者測試了USP7的抑制是否影響SUMO在DNA復制部位的富集。P22077對原代MEFs的處理導致了染色質結合的SUMO2/3共軛物的積累。盡管USP7抑制增加了染色質上SUMO化蛋白的數(shù)量，但它破壞了它們在PCNA病灶的定位（圖5b）。相反，USP7的抑制并沒有改變SUMO2/3和PML之間的共定位（圖5c），從而支持SUMO化蛋白的脫域是對排斥因子的特異性。為了證實這一觀察，作者在USP7抑制劑存在的情況下，進行了iPOND實驗。正如預期的那樣，與成熟染色質相比，SUMO2/3在新生DNA（EdU部分）中富集，USP7的抑制減少了SUMO2/3在復制體周圍的富集。

研究結論：USP7的抑制導致SUMO化蛋白的泛素化，這反過來又促使這些SUMO化的因子遠離復制叉的周圍

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7.USP7缺失概括了USP7抑制劑的作用

????????最后，作者試圖對該發(fā)現(xiàn)進行基因確認。為此，作者使用了USP7條件性敲除（Usp7lox/lox）MEFs30。DNA纖維檢測顯示，USP7缺失后，叉子進展和原點發(fā)射減少。重要的是，與USP7抑制劑的作用類似， Usp7缺失會導致SUMO2/3修飾的染色質結合蛋白的積累。此外，在USP7缺失的MEFs中進行的IF實驗證實了染色質結合的SUMO2/3共軛物的增加，以及SUMO2/3與PCNA的共定位的喪失。

研究結論：USP7是哺乳動物DNA復制所必需的SDUB，并確定USP7是維持復制叉周圍富含SUMO的環(huán)境所需的第一個因素

研究結論：USP7是哺乳動物DNA復制所必需的SDUB，并確定USP7是維持復制叉周圍富含SUMO的環(huán)境所需的第一個因素。

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結論與討論

????????綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)USP7是一個與復制體相關的DUB，可以抵消DNA復制位點的泛素化。USP7的作用有助于維持復制叉周圍高濃度的SUMO化因子。在USP7被抑制后,SUMOylated蛋白被集體移出復制體，從而通過限制復制叉的進展和新起源的啟動而完全廢除了DNA復制。這些發(fā)現(xiàn)闡明了USP7在哺乳動物中的基本性質，在開發(fā)用于抗癌治療的USP7抑制劑時應予以考慮。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/nsmb.3185