一、細(xì)胞外泌體提取（以MSC為例）

I. 準(zhǔn)備

1） 將P3-P4 MSC 培養(yǎng)至70%-80%密度，10cm dish 或者T75裝10ml Mediium；T175裝25ml/瓶

2） 厚壁超速離心管清洗后高溫高壓滅菌備用（勿烘干），高速離心管及超離管蓋、薄壁超離管用70% 乙醇浸泡20min消毒，然后用無菌PBS潤洗晾干。

II. Conditioned medium的收集和處理

實驗試劑： IMDM、PBS

準(zhǔn)備耗材：滅菌好的EP管、滅菌好的玻璃瓶、50ml離心管、500ml玻璃瓶（無菌）

實驗儀器：冷凍離心機(jī)、迷你離心機(jī)

實驗步驟：

1.??? 將細(xì)胞培養(yǎng)至密度達(dá)到70%-80%滿（超離一次可最多離心240ml，即24個10cm Dish or 10個 T175）

2.??? 棄去培養(yǎng)基，PBS潤洗2次；

3.??? 換成同等體積的IMDM（如果需要加藥處理，則在Conditioned medium更換前進(jìn)行預(yù)處理）

4.??? 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48小時 （不同細(xì)胞不一樣，如生長較快的細(xì)胞，培養(yǎng)24小時即可）

5.??? 用移液管將conditioned medium收集到50ml離心管中，300g? 4度離心10min（去除死細(xì)胞）

6.??? 利用移液管收集上清至干凈50ml 離心管中，4℃保存最長1周或置于-80℃保存，或直接進(jìn)行外泌體提?。?/p>

注意：conditioned medium收集后應(yīng)盡快進(jìn)行外泌體的提取，保存時間長會損失一些外泌體，也有研究者保存于-80度中數(shù)個月再提取外泌體。

補(bǔ)充：以下是全細(xì)胞裂解液的制備（total cell lysate）（用于外泌體免疫分析時作為對照組）

1.??? 用胰酶消化1-2個培養(yǎng)皿的細(xì)胞并進(jìn)行計數(shù)；

2.??? 將1-5×107細(xì)胞裝在小型離心管中（EP管）中，300g 4℃ 離心5min，棄上清，重懸在1ml 預(yù)冷的PBS中，再次離心并重懸在1ml 冷PBS中進(jìn)行清洗，再離心棄上清；

3.??? 加200μl (for 1 × 107 cells) 或 1-ml (for 5 × 107 cells) 細(xì)胞裂解液，冰上孵育20min，孵育開始時和結(jié)束時渦旋混勻。（改為超聲30s后50%pulse冰上輕搖15min，2016.01.29）

4.??? 20,000g 4℃離心20min（改為14,000g 4℃離心15min），收集上清至干凈的微型離心管（EP管）中，-20℃保存最多6個月。

III.外泌體的提取

實驗試劑：處理好的細(xì)胞培養(yǎng)基（Conditioned medium） PBS?

實驗儀器：離心機(jī)?? 離心管?? -80°冰箱

實驗步驟：

1.??? 將實驗2中收集處理好的干凈conditioned medium裝入50ml離心管中

2.??? 2000g 4℃離心20min

3.??? 用移液管吸取上清轉(zhuǎn)移至高速離心管中（注意不要污染，留下0.5厘米的上清不要吸）

4.??? 用記號筆標(biāo)記高速離心，標(biāo)記面朝上放置，16500g 4℃離心30min

5.??? 用移液管吸取上清至新的超速離心管（Type 50.2）里（盛0.5cm液面時就不要吸了）

6.??? 120,000g 4℃離心最少70min

注意：本步驟超速離心應(yīng)保證每個離心管均至少有3/4液體，若不足，則應(yīng)加PBS補(bǔ)足；時間超過70min(不超過3小時)并不會破壞exosome，即保證100000g離心大于60min

7.??? 完全棄除上清

注意：如為固定角度的轉(zhuǎn)子，則本步驟可以傾倒棄除上清；如為懸吊式轉(zhuǎn)子，則應(yīng)用移液管吸棄上清，最后剩2mm液面即可

8.??? 在每管離心管中加入1ml 預(yù)冷PBS，用微量移液器（micropipettor）將沉淀重懸，將同一組細(xì)胞的管子的液體混合放到同一個超速離心管（Type 50.2或SW41均可）里，再加入PBS補(bǔ)足管內(nèi)體積。

注意：本步驟可能并不能肉眼看見沉淀物

9.??? 120,000g 4℃離心60min

10.? 盡可能地棄除上清液，用移液管和微量移液器緩慢棄去上清

11.? 重懸沉淀（即exosome）：加少量（100μl/6 10cm dish）的預(yù)冷PBS重懸

12.? 分出10ul裝于新EP管用于測量蛋白濃度，剩余可100μl/EP管分裝成小管-80℃冰箱保存

參考文獻(xiàn)：Thery C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 2006 Chapter 3:Unit 3 22

二、植物外泌體的提取

1.?????? 對于多汁植物，清潔外皮，使用擠汁器榨汁；對于少汁植物，切成6mm×6mm×6mm左右的小塊，使用榨汁機(jī)榨汁。收集到50ml離心管中。每次提取需集滿4個50ml離心管。

2.?????? 照217的超凈臺。以 3000g 30min 4℃離心以去除死細(xì)胞，收集上清液至高離管（4管→6管）。

3.?????? 以 10000g 60min 4℃離心以去除細(xì)胞碎片。收集上清液。

4.?????? 以 150000g 90min 4℃離心，保留沉淀。每管用2ml 8%蔗糖溶液重懸。

5.?????? 可配制4~6管蔗糖梯度溶液（自上而下15%、30%、45%、60%，各1.5ml）。務(wù)必輕柔操作，以形成分層。

6.?????? 繼而輕柔加入有蔗糖梯度溶液的超離管中。

7.?????? 以 150000g 90min 4℃離心，保留可見的各組分（若能看到條帶，則吸取之；否則，兩組分均收集。實際使用時選擇15/30%和[或]30/45%的）。

8.?????? 剩余100 ul用作NTA/TEM檢測，放入-80℃。

三、動物血清外泌體的提取

1.?????? 獲得血漿：新鮮的全血1600g 20min 4℃離心。通常將1~2ml血漿作為一個樣本。

2.?????? 血漿10000g 30min 4℃離心，去掉細(xì)胞碎片等。下接3.1或3.2。

3. 1 ???? 上清稀釋至~6ml，加入Quick-seal超離管（#344619），100000g 70min 4℃離心×2。

3. 2????? 或使用SBI的試劑盒（例如血清是EXOQ5A），按比例加入后低俗離心即可見沉淀。

4.?????? 上接3.1或3.2。用100ul/超離管預(yù)冷的PBS稀釋，充分吹打。