喵喵 | 3-4 表達載體構建

1??基因表達載體構建

1. 目的

構建基因表達載體是為了使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，復制，表達。

2. 過程

3. 基因表達載體的組成

基因表達載體包含目的基因、啟動子、終止子、標記基因，（復制原點）。

啟動子：RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄

終止子：RNA聚合酶脫離部位，終止轉錄

標記基因：用于鑒別受體細胞中是否含有目的基因，例如抗生素抗性基因，熒光蛋白合成基因等

（1）單酶切和雙酶切

①單酶切的弊端

單酶切的結果：目的基因和質粒的正向連接，目的基因和質粒的反向連接，目的基因或質粒自連。只有目的基因和質粒的正向連接是基因工程中所需要的重組DNA。

②雙酶切的優(yōu)勢

雙酶切能保證目的基因與運載體定向連接，防止目的基因與運載體發(fā)生任意連接或自連。

例題1

質粒上有多種限制酶的切點，若目的基因上也有上述質粒中相應限制酶的切點，為避免目的基因自身的環(huán)化并能與圖中質粒準確重組，可選用的限制酶是

A. Nde l和Xba l【Xba l在其他地方也有】

B. Nde Ⅰ和BamH l?

C. Xba l【這是單酶切】

D. Pst l和BamH l

2??目的基因導入受體細胞

植物細胞

常用方法：農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法

受體細胞：體細胞（具有全能性）

過程：（農桿菌轉化法）

• ①將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA上
• ②將含目的基因的重組Ti質粒轉入農桿菌
• ③將含重組Ti質粒的農桿菌導入植物受體細胞
• ④T-DNA轉移至受體細胞并將目的基因整合到受體細胞的染色體DNA上，維持穩(wěn)定和表達

動物細胞

常用方法：顯微注射法

受體細胞：受精卵（全能性高）

過程：

• ①將含目的基因的表達載體提純
• ②取受體細胞，用顯微注射儀進行顯微注射

微生物細胞

常用方法：Ca2?處理法

受體細胞：大腸桿菌等（繁殖快、多為單細胞、遺傳物質較少）

過程

• ①Ca2?處理細胞，使之成為感受態(tài)細胞
• 感受態(tài)細胞：能夠從周圍吸取DNA分子
• ②將基因表達載體溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合
• ③一定溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子，完成轉化

例題2

采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導入目的基因的做法正確的是

①將毒素蛋白注射到棉受精卵中

②將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中

③將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質粒重組，導入細菌，用該細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養(yǎng)

④將編碼毒素蛋白的DNA序列，與細菌質粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵

A. ①②

B. ②③

C. ③④

D. ①④?

例題3

下列受體細胞與導入方法的匹配，正確的是

A. 棉花細胞——花粉管通道法

B. 羊受精卵——基因槍法【顯微注射法】

C. 大腸桿菌——農桿菌轉化法【Ca2?轉化法】

D. 農桿菌——農桿菌轉化法【Ca2?轉化法】

3??目的基因的檢測與鑒定

探針：在含目的基因的DNA片段上用放射性同位素（或熒光分子）標記

【DNA分子雜交技術】將轉基因生物的基因組提取出來，在含目的基因的DNA片段上用放射性同位素（或熒光分子）標記，以此作為探針，使探針與基因組DNA雜交，若顯示出雜交帶，就表明目的基因已導入受體細胞。

【核酸分子雜交技術】從轉基因生物中提取出mRNA，同樣用標記的目的基因作探針與mRNA雜交，若顯示出雜交帶，則表明目的基因轉錄出了mRNA。

【抗原-抗體雜交技術】從轉基因生物中提取出蛋白質，用相應的抗體進行抗原-抗體雜交。若有雜交帶出現(xiàn)，表明目的基因已表達合成出蛋白質。

例題4

下列關于核酸分子雜交和抗原-抗體雜交的敘述，正確的是

A. 核酸分子雜交是指兩條脫氧核苷酸鏈的雜交【也可以mRNA和單鏈的DNA雜交，只要能堿基互補配對都可以叫做核酸分子雜交】

B. 抗原-抗體雜交的原理為堿基互補配對原則【抗原-抗體是蛋白質】

C. 核酸分子雜交可檢測目的基因的存在和轉錄?【存在是DNA跟DNA雜交，轉錄是mRNA跟DNA分子雜交】

D. 抗原-抗體雜交中目的基因產物常作為抗體【抗原】