Netrin-1是一種胚胎分泌型層粘蛋白相關(guān)糖蛋白，在神經(jīng)元信息傳遞、血管生成和細(xì)胞存活中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Netrin-1主要在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)，但在很大一部分人類腫瘤中，它被癌細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境重新表達(dá)。特別是在炎癥相關(guān)的結(jié)腸直腸癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、淋巴瘤和黑色素瘤中，這種情況已經(jīng)得到證實(shí)。在模擬這些疾病的臨床前模型中，網(wǎng)織蛋白-1 及其受體之間的干擾足以引發(fā)癌細(xì)胞死亡并誘導(dǎo)腫瘤生長抑制?；谶@些發(fā)現(xiàn)，一種能中和網(wǎng)織蛋白-1 并阻斷網(wǎng)織蛋白-1-UNC5B 相互作用的單克隆抗體（mAb）被開發(fā)

2023年8月2日，發(fā)表在《Nature》雜志上的一篇題為“Netrin-1 blockade inhibits tumour growth and EMT features in endometrial cancer”的文章，研究了Netrin-1在子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinomas，ECs）中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明了使用抗Netrin-1抗體（NP137）可以有效減少EC小鼠模型中的腫瘤進(jìn)展。

現(xiàn)漢恒有Netrin-1相關(guān)基因產(chǎn)品，超值限量活動(dòng)！

首先，作者使用Pten f/f缺失小鼠模型（即他莫昔芬誘導(dǎo)的CAG-CreERT+/-啟動(dòng)子）來重現(xiàn)EC進(jìn)展情況。用NP137（10 mg kg-1，每周三次）處理對照組和Pten缺失小鼠3-4周，并分析netrin-1的表達(dá)和腫瘤進(jìn)展。Pten 基因缺失后，小鼠腫瘤中的 netrin-1 上調(diào)，而 NP137 治療后這種上調(diào)降低。病理學(xué)家觀察到NP137 治療后癌細(xì)胞數(shù)量減少，子宮內(nèi)膜組織更健康。同樣，在用 NP137 治療的小鼠甲狀腺中也觀察到了抗腫瘤活性。這些結(jié)果表明，在EC中靶向netrin-1可抑制腫瘤進(jìn)展。

圖1. 阻斷 Netrin-1 可抑制臨床前模型中子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)展

之前的研究結(jié)果表明，阻斷內(nèi)皮素-1 是一種可行的癌癥治療策略，基于此，作者開發(fā)了一種用于臨床的netrin-1阻斷抗體，目前正在進(jìn)行 I/II 期評估。從正在進(jìn)行的 1 期研究中提取了 14 例 EC 患者的療效數(shù)據(jù)。在這項(xiàng)研究中，NP137 作為單藥療法每兩周給藥一次（Q2W），直到臨床/放射學(xué)進(jìn)展為止。沒有觀察到劑量限制性毒性，超過半數(shù)的患者（14 人中有 8 人）的最佳反應(yīng)是疾病控制（疾病穩(wěn)定）（最佳總體反應(yīng)，疾病穩(wěn)定，57.1%）。此外，一名 74 歲的女性晚期心肌梗死患者獲得了 RECIST1.1 定義的部分反應(yīng)。該患者最初的診斷結(jié)果顯示其為子宮內(nèi)膜樣病變，微衛(wèi)星表型穩(wěn)定，表達(dá) CK7、PAX8 和雌激素受體，但沒有表達(dá) CK20 或孕酮受體。在使用 NP137 之前，她曾接受過多種治療嘗試，包括輔助放療和卡鉑-紫杉醇治療，然后使用魯比替丁作為轉(zhuǎn)移性疾病的一線治療，以及第二次使用卡鉑-紫杉醇治療，但盡管使用了這些治療方法，肝轉(zhuǎn)移灶仍出現(xiàn)了進(jìn)展。入院時(shí)進(jìn)行的正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（PET-CT）證實(shí)了氟脫氧葡萄糖的強(qiáng)烈攝?。–1D1之前）。她接受了 14 毫克/公斤-1 靜脈注射 NP137 Q2W，并在 6 周后（即 NP137 第 3 周期后）接受了 PET-CT 掃描，結(jié)果顯示，根據(jù) RECIST v.1.1 標(biāo)準(zhǔn)，肝臟靶病灶縮小了 51%，出現(xiàn)了部分反應(yīng)。3 個(gè)月時(shí) PET-CT 掃描證實(shí)了初步反應(yīng)，6 個(gè)月時(shí)靶病灶縮小 55%，再次證實(shí)了初步反應(yīng)。該患者在接受了 17 個(gè)周期的 NP137 治療后，最終出現(xiàn)了疾病進(jìn)展，并繼續(xù)接受了來曲唑 A、免疫療法和他莫昔芬等其他治療，但未再出現(xiàn)客觀腫瘤反應(yīng)。

圖2. EC患者接受NP137治療后的臨床反應(yīng)

為了深入了解將netrin-1阻斷與腫瘤生長抑制聯(lián)系起來的潛在機(jī)制，首先根據(jù)netrin-1阻斷的假設(shè)作用模式，分析了在用NP137治療的Pten f/f腫瘤中，腫瘤生長抑制是否與腫瘤細(xì)胞死亡有關(guān)。通過對活性 caspase-3 的 IHC 檢測，NP137 增加了癌癥凋亡。接下來，對接受 NP137 治療與未接受治療的 Pten f/f 小鼠腫瘤進(jìn)行了 RNA 序列分析。在服用 NP137 后改變的通路/基因中，觀察到 EMT 相關(guān)基因在治療后有所減少。一些體外研究表明，netrin-1參與了EMT，它通常與PI3K/AKT通路有關(guān)，而PI3K/AKT通路在子宮內(nèi)膜癌中經(jīng)常發(fā)生改變。隨后研究了 NP137 是否會(huì)影響 Pten f/f 小鼠模型中腫瘤的 EMT。首先評估了對照組與經(jīng) NP137 處理的腫瘤中 EpCAM 上皮標(biāo)記物的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng) NP137 處理的腫瘤中這種上皮標(biāo)記物的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著增加。為了更全面地了解腫瘤基因的表達(dá)情況，采用了一種常用的胰腺癌 EMT 特征，該特征可用于確定 EMT 評分。觀察到，用NP137治療后，EMT評分降低，間質(zhì)基因表達(dá)減少，上皮基因表達(dá)增加。這些臨床前數(shù)據(jù)支持這樣一種觀點(diǎn)，即阻斷netrin-1對腫瘤細(xì)胞具有雙重作用：引發(fā)癌細(xì)胞死亡和抑制EMT特征，使NP137處理過的腫瘤總體上更具上皮性。

圖3. 在臨床前小鼠模型中，阻斷 Netrin-1 可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制 EMT

接下來要確定的是，在臨床前模型中觀察到的對EMT特征的抑制是否也發(fā)生在接受NP137治療的患者身上。在 NP137 1 期試驗(yàn)中，在上述 EC 患者中收集了納入時(shí)（C1D1）和使用抗網(wǎng)狀蛋白-1 復(fù)合物治療 1 個(gè)月后（即第三次輸注 NP137 之前（C3D1））的配對活檢組織。對治療前和治療時(shí)的 12 個(gè)成對活檢組織成功進(jìn)行了大容量 RNA 序列分析。發(fā)現(xiàn)注射兩次NP137就足以使上述胰腺癌EMT評分顯著下降，這表明在接受NP137治療1個(gè)月后，患者的腫瘤表型總體上更加上皮化。在接受 NP137 治療的患者腫瘤樣本中，EpCAM IHC 染色增加，證實(shí)了腫瘤上皮表型的轉(zhuǎn)變。還觀察到共同表達(dá)泛影角蛋白和波形蛋白的腫瘤細(xì)胞比例有所下降。

圖4. NP137治療可抑制EC患者的EMT

為了將這些研究擴(kuò)展到單細(xì)胞水平，直接對一名晚期 EC 患者在 NP137 試驗(yàn)中納入時(shí)（C1D1，9,216 個(gè)細(xì)胞）和治療 1 個(gè)月后（C3D1，7,159 個(gè)細(xì)胞）獲得的新鮮活檢組織進(jìn)行了 3′單細(xì)胞 RNA-seq 分析（10x Genomics Next GEM 3′kit）。無監(jiān)督聚類顯示存在不同的細(xì)胞群，包括腫瘤細(xì)胞（表達(dá) EpCAM、PGR 和 TFF3，這些都是 EC 的標(biāo)記）、免疫細(xì)胞（以 CD45 (PTPRC) 表達(dá)為標(biāo)志）、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF，以 αSMA (ACTA2) 為標(biāo)志）和內(nèi)皮細(xì)胞（PECAM1 陽性）。使用NP137治療后，腫瘤細(xì)胞區(qū)系的減少在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著意義。NP137 治療兩個(gè)周期后，抗netrin-1治療后的腫瘤細(xì)胞比例降低了 3.19 倍。值得注意的是，除了癌細(xì)胞的凈減少外，還注意到整個(gè)腫瘤區(qū)的 EMT 評分也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著下降，這表明 NP137 治療后腫瘤表型總體上更加上皮化。

圖5. 一名心肌梗死患者活檢前后的單細(xì)胞 RNA 序列分析

腫瘤區(qū)發(fā)生的變化也與基質(zhì)細(xì)胞的變化有關(guān)。值得注意的是，NP137 處理似乎對免疫細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的影響。更具體地說，在 NP137 治療后，觀察到具有細(xì)胞毒性功能的淋巴細(xì)胞（CD8+ T 細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞）有所增加。值得注意的是，NP137 治療后，在 01-40 號患者的單細(xì)胞分析以及 01-034 和 01-039 號患者的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，T 細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用在數(shù)量和強(qiáng)度上都有所增加。特別是，單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，CD8+ T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間相互作用的數(shù)量和強(qiáng)度都有所增加。NP137 治療與更有效的抗原遞呈細(xì)胞 (APC) 有關(guān)，因?yàn)橛^察到與癌細(xì)胞相互作用的抗原遞呈細(xì)胞明顯從 C1D1 中的單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)?C3D1 中的樹突狀細(xì)胞。

圖6. 從一名子宮內(nèi)膜腺癌患者活檢前后的單細(xì)胞 RNA 截圖分析中觀察到的免疫學(xué)變化

總之，本研究利用臨床前模型以及EC患者治療前和治療中的活組織切片證明，NP137的全身治療可減少腫瘤的EMT特征。通過單細(xì)胞分析表明，EMT 特征的變化與腫瘤微環(huán)境的變化有關(guān)。該結(jié)果表明，Netrin-1阻斷是一種臨床策略，可同時(shí)觸發(fā)腫瘤剝脫和EMT抑制，從而有可能減輕對標(biāo)準(zhǔn)療法的耐藥性。