一、概述

?1 什么是生物素

生物素又稱維生素H、輔酶R，是水溶性維生素，也屬于維生素B族，B7。它是合成維生素C的必要物質(zhì)，是脂肪和蛋白質(zhì)正常代謝不可或缺的物質(zhì)。

是一種維持人體自然生長、發(fā)育和正常人體機(jī)能健康必要的營養(yǎng)素。當(dāng)缺乏生物素時(shí)，易引起頭皮屑增多，掉發(fā)，少年白頭，皮膚炎等癥狀。嬰幼兒缺乏生物素，易造成生長發(fā)育受阻，骨骼生長不良。

2 檢驗(yàn)的必要性

人體必須的大多數(shù)維生素，機(jī)體不能合成或合成量不足，不能滿足機(jī)體的需要，必須經(jīng)常通過食物中獲得。生物素也是如此。所以我們要檢驗(yàn)食品中生物素的含量，保證人體攝入量能滿足身體需求。

二、食品中生物素的測定

食品中生物素的測定：GB 5009.259-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)?食品中生物素的測定》

1 適用范圍：本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中生物素的測定方法，適用于食品中生物素的測定。

2 基本要求

2.1 檢驗(yàn)環(huán)境要求：生物素測定工作在一級生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行即可。由于生物素涉及的菌株是無害的植物乳桿菌，所以無需在二級生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。樣品檢驗(yàn)時(shí)注意不同樣品間器具分開，避免交叉污染。同時(shí)由于維生素測定試驗(yàn)的敏感性，所以要特別防止環(huán)境對樣品和操作過程的污染。

2.2 檢驗(yàn)人員要求：檢驗(yàn)人員應(yīng)具備生物安全上崗證，壓力容器上崗證，微生物檢驗(yàn)人員上崗證。進(jìn)入潔凈工作區(qū)前，檢驗(yàn)人員需要二次更衣，佩戴帽子、口罩、一次性無菌手套，換鞋。

2.3 檢驗(yàn)設(shè)備要求：使用儀器需要定期進(jìn)行檢定/校準(zhǔn)，每次使用儀器前需填寫使用記錄，開生物安全柜，紫外線照射30分鐘，酒精消毒臺面。

2.4 檢驗(yàn)用培養(yǎng)基：檢驗(yàn)用培養(yǎng)基均應(yīng)符合GB 4789.28-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)?食品微生物學(xué)檢驗(yàn)?培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》。按生物素測定國標(biāo)規(guī)定，選用乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基、生物素測定培養(yǎng)基。

2.5 生物垃圾的處理：所有生物垃圾應(yīng)經(jīng)121℃高壓滅菌20min后，方可運(yùn)離實(shí)驗(yàn)室，并按醫(yī)療廢棄物處理。

3 食品中生物素的測定

3.1 實(shí)驗(yàn)前處理

3.1.1 實(shí)驗(yàn)前玻璃器皿的處理：使用前將玻璃器皿進(jìn)行洗刷。用活性劑，如月桂基磺酸鈉或家用洗滌劑加入到洗滌用水中即可，對硬玻璃測定管及其他必要的玻璃器皿進(jìn)行清洗，清洗之后200℃干熱2h后方可使用。

3.1.2 實(shí)驗(yàn)前樣品的處理

3.1.3 試驗(yàn)試劑的配制：生物素測定試驗(yàn)會用到很多試劑均需要提前準(zhǔn)備，包括50%乙醇溶液、0.5mol/L氫氧化鈉溶液、0.85%氯化鈉溶液、1mol/L鹽酸溶液、檸檬酸鹽緩沖液（pH4.5）、蛋白酶-淀粉酶液、3%硫酸溶液。這些試劑按照國標(biāo)上的要求和成分自行配制即可，其中蛋白酶-淀粉酶液需要現(xiàn)配現(xiàn)用。

3.1.3 實(shí)驗(yàn)前培養(yǎng)基配制：培養(yǎng)基可購買商品化脫水合成培養(yǎng)基，也可以購買培養(yǎng)基成分自行配制。生物素測定的3種培養(yǎng)基分別是：乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基和生物素測定用培養(yǎng)基。前兩種都涉及標(biāo)準(zhǔn)菌種活化，所以需要提前配制。用天平稱取一定量干粉培養(yǎng)基，加入適量番茄汁和蒸餾水，電爐/微波爐煮沸，分裝試管，121℃高壓滅菌15min，備用。乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基需擺成斜面。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

3.2.1 配制生物素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：濃度100μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)品要求純度≥99%。用天平稱取100mg 生物素標(biāo)準(zhǔn)品，置于燒杯中，用50%乙醇溶液溶解后轉(zhuǎn)移至1000mL稱量瓶中，燒杯用50%乙醇溶液清洗三次，清洗液均加入容量瓶，避免燒杯中有生物素殘留，定容至刻度?？纱鎯τ谧厣恐?，于2-4℃冰箱保存12個月。?

3.2.2 配制生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液：生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液濃度1.0μg/mL，準(zhǔn)確吸取1mL生物素標(biāo)準(zhǔn)儲備液置于100mL棕色容量瓶中，用50%乙醇溶液稀釋并定容至刻度，混勻后儲存于瓶中2-4℃冰箱，可保存6個月。

3.2.3 配制生物素標(biāo)準(zhǔn)工作液：生物素標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度10.0ng/mL，準(zhǔn)確吸取1mL生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液置于100mL棕色容量瓶中，用水稀釋，定容至刻度，混勻，臨用前現(xiàn)配。

3.2.4 配制標(biāo)準(zhǔn)使用工作液：生物素標(biāo)準(zhǔn)使用工作液，高濃度溶液為0.2ng/mL和低濃度溶液為0.1ng/mL。從標(biāo)準(zhǔn)工作液中吸取兩次各5mL，分別加入一個250mL容量瓶和一個500mL容量瓶，分別用水定容到250mL和500mL即可。

3.3 菌種的制備與保存

3.3.1 儲備菌種的制備：將標(biāo)準(zhǔn)菌種植物乳桿菌（菌號：ATCC8014）劃線接種至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基斜面上，在37±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20-24h，之后放入2-4℃冰箱作為儲備菌株保存，每月至少傳代一次。實(shí)驗(yàn)前將儲備菌種從冰箱取出，接種至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基中，于37±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20-24h以活化菌株，準(zhǔn)備用于接種液的制備。如果儲備菌株在冰箱保存時(shí)間達(dá)數(shù)周以上，不能立刻接種用于接種液制備，需要連續(xù)傳2-3代保證菌活力回復(fù)后，再進(jìn)行接種液制備。

3.3.2 接種液的制備：用接種環(huán)將活化的菌株轉(zhuǎn)種至已滅菌的乳酸桿菌肉湯中，于37±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-20h，取出后將菌懸液離心，棄去上清液，再用0.85%氯化鈉溶液振勻并離心，棄去上清液，如此三次。最后用0.85%氯化鈉溶液稀釋至透光率80%。

3.4 樣品測定

3.4.1 試樣提取：此法適用于包含原生和添加生物素的樣品提取。例如嬰幼兒配方食品、谷物類等制品。準(zhǔn)確稱取適量試樣（m），約含0.2～0.5μg生物素，精確至0.001g。以嬰幼兒配方奶粉為例，可以根據(jù)添加量計(jì)算稱樣量和稀釋倍數(shù)，最終把濃度控制在0.01～0.1ng/mL范圍內(nèi)。

稱一定量樣品至一個250mL錐形瓶中，加100mL硫酸溶液，于121℃高壓水解30min，試樣取出后冷卻。用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.5±0.2，轉(zhuǎn)到250mL容量瓶中，用水定容，充分混合。用濾紙過濾，棄去最初的幾毫升。吸取濾液5mL，加入約20mL水，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為6.8±0.2。轉(zhuǎn)至100mL容量瓶中，用水定容至刻度。所以樣品的稱量數(shù)取決于對樣品中生物含量的預(yù)估，使最終試樣稀釋后生物素濃度控制在0.01～0.1ng/mL范圍內(nèi)即可。

3.4.2 質(zhì)控：準(zhǔn)確稱取適量已知濃度的標(biāo)樣，約含0.2～0.5μg生物素，精確值0.001g，后續(xù)處理方法同樣品。

3.4.3 加標(biāo)回收：準(zhǔn)確稱取適量試樣，約含0.2～0.5μg生物素，精確值0.001g，加入含等量生物素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，后續(xù)處理方法同樣品。

3.4.5 試樣稀釋：如果需要，進(jìn)行適度稀釋，使試樣稀釋液中生物素含量最終控制在0.01～0.1ng/mL范圍內(nèi)。

3.4.6 測定系列管制備：取四支試管，分別加入1ml、2ml、2ml、4ml試樣提取液，即為Vx，補(bǔ)水至5mL。加入5mL生物素測定用培養(yǎng)液，混勻，每個梯度做3個平行。如表1所示。

3.4.7 標(biāo)準(zhǔn)系列管制備：如表2所示。取試管分別加入生物素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、水和培養(yǎng)液，混勻，每個梯度做3個平行。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，以每點(diǎn)平均值計(jì)算。

將上述試管蓋上試管帽，包括標(biāo)準(zhǔn)系列管和試樣系列管，于121℃高壓滅菌5min，取出快速冷卻至室溫，備用。

3.4.8 培養(yǎng)：在無菌條件下，用移液器或無菌針管向每只測定管接種1滴接種液，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線管中未接種空白和樣品空白不接種。置于37±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)19-20h，直至獲得最大渾濁度，即在培養(yǎng)兩小時(shí)透光率無明顯變化。

3.4.9 測定：將培養(yǎng)好的測定管用渦漩混勻器混勻。用厚度為1cm的比色杯，于550nm處，以接種空白管調(diào)節(jié)透光率為100%，然后依次測定標(biāo)準(zhǔn)系列管和試樣系列管的吸光度值。如果未接種空白對照有明顯的細(xì)菌增長，說明可能有雜菌混入，需重做試驗(yàn)。

3.5 結(jié)果分析

3.5.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)系列管生物素含量為橫坐標(biāo)，每個標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)吸光度值均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.5.2 樣液結(jié)果計(jì)算：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上的公式計(jì)算出試樣系列管中生物素的相應(yīng)含量Cx。如果每個試樣的3個測試管中有2個值落在0.01ng～0.1ng范圍內(nèi)，且每個測試管之間吸光值偏差小于10%，則按式（1），式（2）進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。

3?生物素檢驗(yàn)系統(tǒng)成立

? ?3.1質(zhì)控標(biāo)樣的檢測結(jié)果應(yīng)符合說明書給出的檢測范圍；

? ?3.2?加標(biāo)回收率在90%～110%；

? ?3.3?在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立的測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。

? ?3.4?線性范圍是指利用一種方法取得精密度、準(zhǔn)確度均符合要求的試驗(yàn)結(jié)果，而且成線性的供試物濃度的變化范圍，其最大量與最小量之間的間隔，可用mg/L-mg/L、μg/mL-μg/mL等表示。

? ?檢出限是方法能檢出某物質(zhì)時(shí)的最低濃度。

? ?定量限是方法能準(zhǔn)確定量出某物質(zhì)時(shí)的最低濃度。

? ?本方法線性范圍為0.01μg/mL-0.1μg/mL，檢出限為2.0μg/100g，定量限為4.0μg/100g

三、注意事項(xiàng)

1 試驗(yàn)玻璃器皿專用。微生物法測定維生素的要求較高，所以實(shí)驗(yàn)室所有玻璃器皿要與其他微生物試驗(yàn)區(qū)分開。注意所有玻璃器皿要仔細(xì)清洗。

2 整個試驗(yàn)操作要避免微生物污染和外來生物素污染，所以操作要格外注意。

3 保證標(biāo)準(zhǔn)菌株活力。標(biāo)準(zhǔn)菌的活力對試驗(yàn)結(jié)果影響很大，一定要按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定對標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行傳代，保證活力。

4 把握好培養(yǎng)終止時(shí)間。要密切監(jiān)測最高濃度試管的渾濁度，一旦出現(xiàn)最大混濁度要立刻終止培養(yǎng)開始測定吸光度。

5 稀釋定容一定要準(zhǔn)確。標(biāo)準(zhǔn)品和試樣都會進(jìn)行高倍數(shù)稀釋，所以一定要準(zhǔn)確，避免誤差過大。

來源：中食標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)信息網(wǎng)

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