鏈霉親和素,HRP標(biāo)記(Streptavidin,HRP conjugated)操作步驟：

(一)獲得目的基因

1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設(shè)計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

(二)構(gòu)建重組表達(dá)載體

1、鏈霉親和素,HRP標(biāo)記(Streptavidin,HRP conjugated)載體酶切:將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

(三) ?獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種

1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。

2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。

(四)誘導(dǎo)表達(dá)

1、 鏈霉親和素,HRP標(biāo)記(Streptavidin,HRP conjugated)挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yǎng)。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。

3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。

4、分別取菌體1ml,?離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。

5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

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艾美捷Biogradetech鏈霉親和素詳情：

中文名稱：鏈霉親和素,HRP標(biāo)記

英文名字：HRP, Streptavidin

貨號：D-AKE21000-100uL

規(guī)格：100uL

應(yīng)用類型：WB/IHC/ELISA

保存建議：自發(fā)貨之日起，-20°C可穩(wěn)定保存1年。為最大限度的避免損失，請在打開管蓋之前融化抗體并離心。建議使用前分裝以避免反復(fù)凍融。

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鏈霉親和素,HRP標(biāo)記可用于檢測生物素分子及生物素標(biāo)記物質(zhì)。此產(chǎn)品建議使用濃度:

1.?免疫印跡1:200-500?。

2.?免疫組化:1:200-1000?。

3. Immunocytocehmistry:1:200-1000

4.?酶聯(lián)免疫吸附試驗1:200-2000