原核表達系統(tǒng) 表達調(diào)控方式 組成型,誘導型 表達產(chǎn)物定位 分泌型,不分泌型(細胞內(nèi),細胞膜,周質(zhì)空間) 產(chǎn)物純化方式 是否融合蛋白,是否一步親和純化 產(chǎn)物溶解狀況 可溶,包含體,分泌型
在各種表達系統(tǒng)中，最早被采用進行研究的是原核表達系統(tǒng)，這也是目前掌握最為成熟的表達系統(tǒng)。該項技術(shù)的主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體(一般為質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化細菌(通常選用的是大腸桿菌)，通過IPTG誘導并最終純化獲得所需的目的蛋白。其優(yōu)點在于能夠在較短時間內(nèi)獲得基因表達產(chǎn)物，而且所需的成本相對比較低廉。但與此同時原核表達系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點：如通常使用的表達系統(tǒng)無法對表達時間及表達水平進行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達可能會對宿主細胞產(chǎn)生毒害作用，過量表達可能導致非生理反應(yīng)，目的蛋白常以包涵體形式表達，導致產(chǎn)物純化困難；而且原核表達系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達產(chǎn)物的生物活性較低
為克服上述不足，許多學者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控領(lǐng)域，其優(yōu)點是
①根據(jù)原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設(shè)計，而靶DNA與真核基因調(diào)控序列基本無同源性，故不存在基因的非特異性激活或抑制
②能誘導基因高效表達，可達105倍，為其他系統(tǒng)所不及；
③能嚴格調(diào)控基因表達，即不僅可控制基因表達的“開關(guān)”，還可人為地調(diào)控基因表達量
因此，利用真核表達系統(tǒng)來表達目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達系統(tǒng)有酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。

2RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。。RT-PCR用于對表達信息進行檢測或定量。另外，這項技術(shù)還可以用來檢測基因表達差異或不必構(gòu)建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進行。
逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：

1、 依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈

2、 Rnase水解活性：水解RNA雜合體中的RNA

3、 依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA

用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細胞mRNA，三種都可。

實驗方法如下
http://show.bioon.com/protocol/smallclass.asp?typeid=1724&newstype=RT-PCR

3 質(zhì)粒是染色體外能夠進行自主復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子。現(xiàn)在習慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。許多細菌除了染色體外，還有大量很小的環(huán)狀DNA分子，這就是質(zhì)粒(plasmid)（補充：部分質(zhì)粒為RNA）。質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱為附加體(episome)，這類質(zhì)粒能夠整合進細菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。
目前，已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子(簡稱cccDNA)。細菌質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量一般較小，約為細菌染色體的0.5%～3%。根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小，大致上可以把質(zhì)粒分成大小兩類：較大一類的相對分子質(zhì)量是40×106以上，較小一類的相對分子質(zhì)量是10×106以下(少數(shù)質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量介于兩者之間)。每個細胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復制特性。按照復制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類：一類是嚴緊型質(zhì)粒，當細胞染色體復制一次時，質(zhì)粒也復制一次，每個細胞內(nèi)只有1～2個質(zhì)粒；另一類是松弛型質(zhì)粒，當染色體復制停止后仍然能繼續(xù)復制，每一個細胞內(nèi)一般有20個左右質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴緊型。分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復制有時和它們的宿主細胞有關(guān)，某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復制屬嚴緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。
在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。人工構(gòu)建的質(zhì)粒可以集多種有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。常用的人工質(zhì)粒運載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環(huán)素基因(Tcr)和抗氨芐青霉素基因(Apr)，并含有5種內(nèi)切酶的單一切點。如果將DNA片段插入EcoRI切點，不會影響兩個抗生素基因的表達。但是如果將DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切點，就會使抗四環(huán)素基因失活。這時，含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細菌抗氨芐青霉素，但對四環(huán)素敏感。沒有DNA插入片段的pBR322會使宿主細菌既抗氨芐青霉素又抗四環(huán)素，而沒有pBR322質(zhì)粒的細菌將對氨芐青霉素和四環(huán)素都敏感。pSC101與pBR322相似，只是沒有抗氨芐青霉素基因和PstI切點。質(zhì)粒運載體的最大插入片段約為10 kb(kb表示為千堿基對)。

4 基因診斷（gene diagnosis）是以探測基因的存在，分析基因的類型和缺陷及其表達功能是否正常，從而達到診斷疾病的一種方法。它是繼形態(tài)學、生物化學和免疫學診斷之后的第四代診斷技術(shù)，它的誕生與發(fā)展得益于分子生物學理論和技術(shù)的迅速發(fā)展。

常用基因診斷技術(shù)：
一、Southern印跡法（Southern blot）

基本原理是：硝酸纖維膜或尼龍濾膜對單鏈DNA的吸附能力很強，當電泳后凝膠經(jīng)過DNA變性處理，覆以上述濾膜，再于其上方壓上多層干燥的吸水紙，借助它對深鹽溶液的上吸作用，凝膠上的單鏈DNA將轉(zhuǎn)移到濾膜上。轉(zhuǎn)移是原位的，即DNA片段的位置保持不變。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，經(jīng)過80℃烘烤的DNA，將原位地固定于膜上。
當含有特定基因片段已原位轉(zhuǎn)移到膜上后，即可與同位素標記了的探針進行雜交，并將雜交的信號顯示出來。雜交通常在塑料袋中進行，袋內(nèi)放置上述雜交濾膜，加入含有變性后探針的雜交溶液后，在一定溫度下讓單鏈探針DNA與固定于膜上的單鏈基因DNA分子按堿基到互補原理充分結(jié)合。結(jié)合是特異的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能結(jié)合上β珠蛋白的探針。雜交后，洗去膜上的未組合的探針，將Ⅹ線膠片覆于膜上，在暗盒中日光進行放射自顯影。結(jié)合了同位素標記探針的DNA片段所在部位將顯示黑色的雜交帶，基因的缺失或突變則可能導致帶的缺失或位置改變。

二、聚合酶鏈反應(yīng)

近年來，基因分析和基因工程技術(shù)有了革命性的突破，這主要歸功于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）的發(fā)展和應(yīng)用。應(yīng)用PCR技術(shù)可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小時內(nèi)體外擴增數(shù)十萬至百萬倍。擴增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用于進一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而通過擴增至百萬倍后直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數(shù)小時。

三、擴增片段長度多態(tài)性

小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA的長度多態(tài)性可以通過PCR擴增后電泳來檢出，并用于致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）連鎖分析法。PCR擴增后，產(chǎn)物即等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析.

四、等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法

當基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時，可以合成等基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素標記進行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測點突變時一般需要合成兩種探針，與正?；蛐蛄型耆恢?，能與之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，這樣，就可以把只有一個堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來.

PCR可結(jié)合ASO，即PCR－ASO技術(shù)，即先將含有突變點的基因有關(guān)片段進行體外擴增，然后再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方法，節(jié)約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進行。

五、單鏈構(gòu)象多態(tài)性診斷法

單鏈構(gòu)象多態(tài)性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指單鏈DNA由于堿基序列的不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同，從而可用于DNA中單個堿基的替代、微小的缺失或手稿的檢測。用SSCP法檢查基因突變時，通常在疑有突變的DNA片段附近設(shè)計一對引物進行PCR擴增，然后將擴增物用甲酰胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置的差異，從而可據(jù)之作出診斷。