?

?細胞基礎(chǔ)信息?

生長特性：貼壁

細胞簡介：293T細胞是一種常見的哺乳動物細胞系，在被用作逆轉(zhuǎn)錄病毒的生產(chǎn)時會產(chǎn)生高滴度的病毒。

?細胞特點?

01.細胞貼壁能力比較弱

293T細胞是貼壁細胞，但其貼壁能力比較弱，容易出現(xiàn)明顯的成片脫落現(xiàn)象。比如：運輸?shù)蜏丶罢鹗?、在室溫條件下靜置時間過長、添加的培養(yǎng)基或其他試劑溫度過低、培養(yǎng)時細胞密度過高、細胞聚集時未吹散、加液吹打時觸碰了細胞表面等。

若脫落現(xiàn)象不嚴重應(yīng)將細胞盡快放回培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，若出現(xiàn)大片脫落的現(xiàn)象需要收集細胞重新消化吹散再接種。

建議使用經(jīng)TC處理后的培養(yǎng)器皿培養(yǎng)細胞，如NEST細胞培養(yǎng)瓶、NEST細胞工廠等。

?

?

02.細胞本身偏嗜酸性，培養(yǎng)基消耗較快

293T細胞在略偏酸性的環(huán)境下生長狀態(tài)更好，在培養(yǎng)過程中需要時刻注意培養(yǎng)基的pH值。在細胞密度達到70%以上時，細胞培養(yǎng)基的消耗速度較快，需要時刻觀察并及時換液。

?

03.細胞生長時聚集成島

293T細胞生長時呈島狀聚集生長，會逐步向外擴散直到完全融合。

?

04.細胞聚集成團之后很難再吹散

293T細胞傳代過程中一定要注意吹散細胞，同時接種的密度不可過高。密度過高容易使細胞抱團，導(dǎo)致難以再次吹散，會在培養(yǎng)器皿中形成類似于球狀的聚集體貼壁生長。導(dǎo)致即使培養(yǎng)條件合適細胞也難以生長。

?細胞培養(yǎng)?

01.細胞凍存

隨著傳代的次數(shù)增加，293T細胞會出現(xiàn)生長狀態(tài)下降，出現(xiàn)突變等現(xiàn)象。所以我們需要在細胞購進時就進行大量凍存，以保證實驗的穩(wěn)定性和持續(xù)性。

2. 在細胞對數(shù)生長期進行凍存，從而增加細胞復(fù)蘇成活率。

3. 倒去細胞上清液并洗去殘留的培養(yǎng)基。

4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后移除。

5. 鏡下觀察，當(dāng)293T細胞變圓且細胞間間隙加大時，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻。

6. 細胞計數(shù)。

7. 將細胞離心，1000rpm，2min。

8.根據(jù)計數(shù)結(jié)果加入細胞凍存液重懸細胞，密度為3×10^6個/mL。

9. 將細胞重懸液分裝進細胞凍存管，進行凍存。

10. 液氮氣象保存24小時后建議復(fù)蘇一管檢測細胞存活率，細胞狀態(tài)等，若細胞活性合格可長期保存，若細胞活性合格率低于80%建議重新凍存。

注：NEST生物樣本庫解決方案提供細胞凍存全流程產(chǎn)品，如NEST凍存管、NEST凍存液、NEST樣本管理系統(tǒng)、NEST凍存架等。

?

02.細胞傳代

1. 當(dāng)細胞生長至匯合率達到80~90%需要對細胞進行傳代操作，以擴大細胞數(shù)量，維持細胞良好的生長狀態(tài)。

2. 吸取干凈原有培養(yǎng)基，加入3-4mL常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20秒后舍棄PBS。

3. 加入適量胰酶，輕輕晃動細胞培養(yǎng)瓶使胰酶與細胞充分混勻，徹底消化細胞。

4. 當(dāng)細胞間隙變大，但并未完全脫落時在細胞培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)基，終止消化。混勻細胞，900rpm離心3-5分鐘后舍棄上清液。

5. 加入新的培養(yǎng)基重選細胞并均勻分到新的細胞培養(yǎng)瓶中，靜置培養(yǎng)。

6. 傳代完成24小時后建議觀察細胞并換液，以去除死亡細胞。?

注：NEST細胞培養(yǎng)瓶規(guī)格齊全，表面經(jīng)過TC處理，細胞貼壁效果極佳。同時NEST已推出新品細胞培養(yǎng)基及細胞鹽溶液（PBS），助力細胞培養(yǎng)。

?

03.細胞復(fù)蘇

1. 當(dāng)細胞傳代次數(shù)過多（超過50代），細胞狀態(tài)變差時或細胞出現(xiàn)污染事故時，需要丟棄原有細胞并對一開始凍存的細胞進行復(fù)蘇。

2. 打開水浴鍋，設(shè)置溫度為40攝氏度。

3. 查看NEST樣本管理系統(tǒng)的記錄，根據(jù)記錄從液氮氣象中取出凍存的細胞，迅速丟入水浴鍋中并快速晃動，在1~2 min內(nèi)使細胞溶液完全溶解。

4. 加入培養(yǎng)基中并混勻后轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶。

5. 放回37攝氏度、3%二氧化碳和95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6. 第二天觀察細胞存活率。倒掉舊的培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基。

注：可使用耐思新推出細胞復(fù)蘇儀替代原始細胞復(fù)蘇過程，細胞復(fù)蘇時間短，細胞存活率高。

?

?Q&A

01.細胞密度如何計算

常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值。這種計算方式優(yōu)點是直觀簡便，但受限于單個細胞在不同的生長密度時所占用的培養(yǎng)面積不同，導(dǎo)致計算并不嚴謹。

?

02.培養(yǎng)過程中細胞碎片較多

??細胞內(nèi)的黑色顆粒是細胞外分泌泡以及細胞器的折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變。而細胞對培養(yǎng)環(huán)境不適應(yīng)、缺乏營養(yǎng)、滲透壓有異常等均可能導(dǎo)致細胞內(nèi)顆粒增加，建議適當(dāng)改變培養(yǎng)條件。

??細胞外的黑色顆粒為細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物，需要先舍棄原有培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除細胞碎片，加入新的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。如果潤洗無法清除細胞碎片，可以等細胞密度處在70-80%左右時消化處理細胞，終止消化之后混勻細胞，收集細胞懸液在900-1000rpm條件下離心3分鐘，舍棄上清液。重懸細胞→離心→再重懸后將細胞懸液接種到新的培養(yǎng)瓶。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果碎片很多，建議用PBS多次潤洗細胞。

?

03.細胞出現(xiàn)聚團現(xiàn)象

??細胞傳代過程中需要盡可能地吹散細胞，并在顯微鏡下確認細胞基本分散后再把細胞接種到培養(yǎng)瓶中。

??優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)體系能有效避免細胞吹散后在貼壁時再聚團的現(xiàn)象， 也可以減輕細胞聚團后無法重新攤開生長的癥狀。

??培養(yǎng)過程中輕微聚團可以稍微延長消化時間，讓大團細胞塊下沉后吸取上層的分散細胞進行傳代。若聚團過于嚴重建議重新培養(yǎng)或者更換培養(yǎng)體系。