摘要

黑色素瘤是一種高度惡性的皮膚腫瘤，侵襲性強(qiáng)，預(yù)后差。1美國國家癌癥研究所估計(jì)，2020 年美國將有大約 100,000 例新的黑色素瘤病例和 6850 例死亡。2黑色素瘤的危險(xiǎn)因素包括淺膚色、紫外線照射、痣、遺傳易感性和黑色素瘤家族史.?2進(jìn)入21世紀(jì)以來，對(duì)黑色素瘤治療的研究，尤其是免疫檢查點(diǎn)抑制劑和BRAF抑制劑的發(fā)現(xiàn)，極大地提高了黑色素瘤患者的生存率。3?,?4然而，雖然黑色素瘤患者的死亡率在下降，但黑色素瘤的發(fā)病率仍在逐年上升。5同時(shí)，PD-1/PD-L1抑制劑和BRAF突變抑制劑的耐藥性也逐漸顯現(xiàn)，這使得探索新的生物標(biāo)志物迫在眉睫。6

Pyroptosis 是一種程序性細(xì)胞死亡的炎癥形式，與細(xì)胞凋亡有許多相似之處，但也存在顯著差異。7細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí)，細(xì)胞膜上會(huì)出現(xiàn)許多孔洞，使細(xì)胞發(fā)生滲透性腫脹和破膜，炎性物質(zhì)排出，引起明顯的炎癥反應(yīng)。7這是細(xì)胞焦亡的形態(tài)特征。早在 1992 年，Zychlinsky 等就觀察到福氏志賀菌可以在宿主巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)這種死亡，但由于當(dāng)時(shí)的知識(shí)有限，仍被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡。8直到 2001 年，Cookson 等人才發(fā)現(xiàn)這種死亡不同于細(xì)胞凋亡，具有 Caspase-1 依賴的特征，這才促使他們首次將其命名為“細(xì)胞焦亡”。9?“Pyro”意為“火”，“ptosis”意為“墜落”，形象地描述了這類死亡的特征。根據(jù)細(xì)胞焦亡機(jī)制的不同，可分為Caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典焦亡途徑和Caspase-4/5/11介導(dǎo)的非經(jīng)典焦亡途徑。10活化的半胱天冬酶切割 Gasdermin 蛋白以形成 N 端結(jié)構(gòu)域 (GSDM-N) 和 C 端結(jié)構(gòu)域 (GSDM-C)。11GSDM-N 具有成孔活性，并被“寡聚化”以在細(xì)胞膜上形成大小不一的孔，介導(dǎo)細(xì)胞的滲透腫脹和炎癥分子如 IL-1β 和 IL-18 的排出。7焦亡是癌癥的一把雙刃劍。一方面，我們可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡以抑制腫瘤生長。另一方面，細(xì)胞焦亡過程中釋放的炎性物質(zhì)形成腫瘤的炎性微環(huán)境，通過激活不同的信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤生長。12細(xì)胞焦亡與癌癥之間的相關(guān)性仍需要進(jìn)一步研究來闡明。其中，細(xì)胞焦亡與黑色素瘤的相關(guān)性尚不清楚。

距離 Jacob 和 Monod 發(fā)現(xiàn) mRNA 已有 60 年了。13他們的重大發(fā)現(xiàn)為“遺傳中心法則”奠定了基礎(chǔ)。14直到今天，“遺傳中心法則”仍然是遺傳學(xué)的經(jīng)典法則。但在 2001 年，人類基因組計(jì)劃發(fā)現(xiàn)只有 1.5% 的核酸序列被轉(zhuǎn)錄成 mRNA 來編碼蛋白質(zhì)，而剩下的 98.5% 通常被認(rèn)為是“垃圾序列”。15隨著研究的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)這些“垃圾序列”可以轉(zhuǎn)錄成多種非編碼RNA。LncRNA就是其中之一，通常是指具有200多個(gè)核苷酸序列的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本，在體內(nèi)平衡調(diào)控和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。16目前，許多研究已經(jīng)證實(shí)了lncRNA與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，但具體的作用網(wǎng)絡(luò)仍不清楚。

在這項(xiàng)研究中，我們探索了黑色素瘤中與細(xì)胞焦亡相關(guān)的 lncRNA，并構(gòu)建了一個(gè)預(yù)后模型，該模型顯示高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的患者預(yù)后較差。我們的結(jié)論可為黑色素瘤的預(yù)后和治療提供一些新的思路

結(jié)果

流程圖如圖所示?圖1.?首先，我們從 TCGA 數(shù)據(jù)庫下載黑色素瘤數(shù)據(jù)。然后，我們構(gòu)建了一個(gè)基于 9 個(gè)與細(xì)胞焦亡相關(guān)的 lncRNA 的預(yù)后模型。隨后，我們研究了高危組和低危組之間免疫浸潤和 m6A 甲基化的差異。最后，我們進(jìn)行了 GSEA 分析。

鑒定了九個(gè)與焦亡相關(guān)的 lncRNA 以計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分

首先，通過Pearson相關(guān)檢驗(yàn)鑒定了與黑色素瘤細(xì)胞焦亡相關(guān)基因密切相關(guān)的lncRNA。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中黑色素瘤細(xì)胞焦亡相關(guān)lncRNA進(jìn)行Cox回歸和Lasso回歸，最終得到9條具有預(yù)后價(jià)值的細(xì)胞焦亡相關(guān)lncRNA。表格1）。通過這 9 個(gè) lncRNA 計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將 457 名 TCGA 的黑色素瘤患者分為高危組和低危組。圖 2A）。

基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的分組模型可有效預(yù)測黑色素瘤患者的預(yù)后

在將黑色素瘤患者分為高危組和低危組后，我們進(jìn)行了生存分析。從圖中可以看出圖 2B，高危組患者生存率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。在圖 2C，以點(diǎn)圖的形式，我們可以直觀地看到高危組患者的生存時(shí)間集中在底部，即生存時(shí)間較短。?圖 2D熱圖反映了 9 個(gè)細(xì)胞焦亡相關(guān) lncRNA 的表達(dá)狀態(tài)與 TNM 分期、性別和年齡等臨床特征之間的關(guān)系。熱圖顯示高危組和低危組患者的 T 分期存在顯著差異。其他臨床特征無顯著差異。

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是影響患者生存的獨(dú)立因素，準(zhǔn)確度高

為了探討風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是否是黑色素瘤患者的獨(dú)立影響因素，對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、年齡、性別、TNM分期等因素進(jìn)行單變量和多變量Cox回歸。數(shù)據(jù)庫中患者的臨床特征如下（表 2）。單因素 Cox 回歸顯示，年齡、分期、T 分期、N 分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是黑色素瘤患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。圖 3A）。多因素 Cox 回歸顯示 T 分期、N 分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是黑色素瘤患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。圖 3B）。ROC曲線顯示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的AUC值為0.821，表明其敏感性（圖 3C）。Nomogram 可以看到風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與 1、3 和 5 年生存率相關(guān)（圖 3D）。校準(zhǔn)表明，Nomogram 可以準(zhǔn)確預(yù)測黑色素瘤患者的 1、3 和 5 年生存率（圖 3E）。

不同人群免疫檢查點(diǎn)與M6A甲基化的相關(guān)性分析

許多免疫檢查點(diǎn)基因在兩組樣本中的表達(dá)不同，并且在低風(fēng)險(xiǎn)組中往往更高（***P<0.001，?圖 4A）。在高危組和低危組樣本中，7個(gè)M6A甲基化相關(guān)基因的表達(dá)存在差異，且均在低危組呈上調(diào)趨勢（***P<0.001；* P < 0.05；圖 4B）。

不同組別免疫細(xì)胞浸潤水平分析

通過TIMER、CIBERSORT、Quantiseq等算法計(jì)算高危組和低危組的免疫浸潤水平。熱圖顯示了不同算法下兩組患者腫瘤微環(huán)境中各個(gè)免疫細(xì)胞浸潤的水平（圖 4C）。我們可以看到，低風(fēng)險(xiǎn)組傾向于在腫瘤微環(huán)境中擁有更高水平的免疫細(xì)胞。

不同組別抗腫瘤藥物敏感性差異分析

研究不同人群對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性，可以為未來治療方案的制定提供幫助。高危人群對(duì)某些藥物更敏感，例如貝沙羅汀、苔蘚他汀和多西他賽。圖 5A）。低危組對(duì)硼替佐米、博舒替尼、喜樹堿等較敏感（圖 5B）。這對(duì)我們根據(jù)群體情況選擇藥物具有指導(dǎo)意義。

基因集富集分析

為了探索高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組之間基因表達(dá)的功能差異，我們進(jìn)行了 GSEA 分析。結(jié)果表明，高危組基因表達(dá)主要與ECM-受體相互作用、癌癥信號(hào)通路和自噬有關(guān)。圖 6A和和Bc）。

討論

細(xì)胞死亡的方式一直是研究的重點(diǎn)。由于癌細(xì)胞具有無限增殖的能力，誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡已成為潛在的治療方向。17程序性細(xì)胞死亡 (PCD) 包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡和鐵死亡。其中，細(xì)胞焦亡在治療癌癥方面具有巨大潛力。18細(xì)胞焦亡在癌癥中起著雙重作用。一方面，我們可以通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞焦亡來減輕腫瘤負(fù)荷；另一方面，癌細(xì)胞的細(xì)胞焦亡可導(dǎo)致炎性物質(zhì)的排出，從而構(gòu)建腫瘤的炎性微環(huán)境，為腫瘤的生長提供條件。7?目前，細(xì)胞凋亡在包括黑色素瘤在內(nèi)的癌癥生理學(xué)中的作用仍不清楚。

LncRNA是一類核苷酸數(shù)大于200的非編碼RNA。已知研究表明，lncRNA在炎癥、腫瘤形成和耐藥性的獲得中發(fā)揮著重要作用。19許多研究已經(jīng)證實(shí) lncRNA 參與細(xì)胞凋亡，但它們?cè)诤谏亓黾?xì)胞凋亡中的作用機(jī)制知之甚少。

在本研究中，我們探索了與黑色素瘤細(xì)胞焦亡相關(guān)的 lncRNA，并確定了具有預(yù)后價(jià)值的 lncRNA。通過 Cox 回歸和 Lasso 回歸，我們構(gòu)建了一個(gè)由 9 個(gè) lncRNA 組成的預(yù)后模型。通過計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，457 名患者被分配到高風(fēng)險(xiǎn)或低風(fēng)險(xiǎn)組。與低危組相比，高危組生存率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。ROC曲線和校準(zhǔn)曲線證明了預(yù)后模型的準(zhǔn)確性。不僅如此，我們發(fā)現(xiàn)免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因和M6A甲基化相關(guān)基因的表達(dá)水平在低風(fēng)險(xiǎn)組中更高。

對(duì)于黑色素瘤這種預(yù)后較差的腫瘤，建立有效的預(yù)后模型并探索其作用機(jī)制可以提高治療效果。目前，免疫檢查點(diǎn)抑制劑和靶向抑制劑在黑色素瘤中取得了良好的治療效果。但這些治療方法會(huì)逐漸產(chǎn)生抵抗力，給患者帶來遺憾。20細(xì)胞焦亡是治療黑色素瘤的一個(gè)有希望的新方向。GSDME是細(xì)胞焦亡途徑中的關(guān)鍵蛋白，在許多癌細(xì)胞中不表達(dá)，但在黑色素瘤中高表達(dá)，成為黑色素瘤的致命弱點(diǎn)。21誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞焦亡可能在改善晚期黑色素瘤的預(yù)后中發(fā)揮潛在作用。22Yu 等人 發(fā)現(xiàn)黑色素瘤中的自噬與細(xì)胞焦亡密切相關(guān)，焦亡是由 EEF-2K 介導(dǎo)的過程。23?Erkes 等人還發(fā)現(xiàn) BRAF 和 MEK 抑制劑可以通過誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞焦亡來改變腫瘤微環(huán)境，從而改善預(yù)后。24由此可見，細(xì)胞凋亡與黑色素瘤之間存在密切的相關(guān)性，具有很大的探索前景。

黑色素瘤是一種高度免疫相關(guān)的腫瘤，免疫檢查點(diǎn)抑制劑的發(fā)現(xiàn)是一個(gè)里程碑。25?CTLA-4 和 PD-1 抑制劑的臨床應(yīng)用使許多黑色素瘤患者受益，大大提高了黑色素瘤患者的無病生存期和總生存期。26探索細(xì)胞焦亡和免疫檢查點(diǎn)之間的串?dāng)_可以進(jìn)一步幫助我們了解細(xì)胞凋亡的臨床意義。根據(jù)我們的結(jié)果，免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因的表達(dá)在低風(fēng)險(xiǎn)組中更高，這表明免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療可能對(duì)低風(fēng)險(xiǎn)組更有益。

表觀遺傳學(xué)存在于廣泛的生物體中，轉(zhuǎn)錄后修飾是一種常見的調(diào)控途徑。27?M6A-甲基化是真核生物中最常見的轉(zhuǎn)錄后修飾。28該過程由甲基化酶（寫入器）、去甲基化酶（擦除器）和甲基化閱讀蛋白（讀取器）介導(dǎo)，參與生物體的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和疾病的發(fā)生發(fā)展。29細(xì)胞中 M6A 甲基化的調(diào)控也成為治療疾病，尤其是腫瘤的新思路。29通過對(duì)細(xì)胞焦亡相關(guān)lncRNA和M6A甲基化相關(guān)基因的相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)低危組的甲基化水平往往更高，這為未來治療黑色素瘤的M6A甲基化提供了思路。同時(shí)，也間接表明焦化與M6A甲基化之間存在一定程度的串?dāng)_。

總而言之，我們的研究建立了黑色素瘤患者焦亡相關(guān) lncRNA 的預(yù)后模型，并研究了其作用機(jī)制。這不僅對(duì)指導(dǎo)預(yù)后有意義，而且可以促進(jìn)黑色素瘤的腫瘤生理學(xué)研究，例如免疫檢查點(diǎn)和M6A甲基化。然而，我們的研究有一些局限性。我們?nèi)狈w內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證 lncRNA 在預(yù)后模型中的表達(dá)和功能，我們將在未來改進(jìn)這方面。

結(jié)論

我們的研究建立了黑色素瘤患者細(xì)胞焦亡相關(guān)lncRNAs的預(yù)后模型，為黑色素瘤細(xì)胞焦亡的研究提供參考，為黑色素瘤的治療提供新思路。但由于缺乏驗(yàn)證，我們的研究存在一些局限性。

方法

數(shù)據(jù)集的信息提取

從數(shù)據(jù)庫中的 TCGA (?https://portal.gdc.cancer.gov/?) 下載的黑色素瘤 RNA 測序數(shù)據(jù)。納入標(biāo)準(zhǔn)為：（1）確診為黑色素瘤的患者；(2)患者有詳細(xì)的lncRNA和臨床信息。共有 457 名黑色素瘤患者符合納入標(biāo)準(zhǔn)，下載了他們的 lncRNA 和臨床信息（排除了隨訪時(shí)間少于 30 天的患者）。

鑒定與細(xì)胞焦亡相關(guān)的 lncRNA

從以前的文獻(xiàn)中獲得了 33 個(gè)凋亡相關(guān)基因。Pearson相關(guān)方法用于鑒定與細(xì)胞焦亡相關(guān)的lncRNA。相關(guān)系數(shù) R?2?>0.3 和 P<0.001 被認(rèn)為是細(xì)胞焦亡相關(guān)的 lncRNA。我們使用 Cytoscape 軟件來可視化 lncRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

預(yù)后性焦亡相關(guān) lncRNA 的鑒定

首先，我們對(duì)細(xì)胞焦亡相關(guān)的 lncRNA 進(jìn)行了單變量 Cox 回歸。我們使用 R 軟件中的包“forestplot”進(jìn)行 COX 回歸分析。然后對(duì)lncRNA進(jìn)行Lasso回歸，P<0.05，對(duì)得到的結(jié)果進(jìn)行多變量Cox回歸。根據(jù)最終結(jié)果計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。使用回歸系數(shù)（β），評(píng)分公式為：

。使用中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。

預(yù)后模型的構(gòu)建

將患者分為高危組和低危組后，對(duì)兩組進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，以確定模型的預(yù)后價(jià)值。通過校準(zhǔn)曲線和ROC曲線驗(yàn)證所建立的預(yù)后模型的準(zhǔn)確性。我們使用 R 軟件中的“plotROC”包來繪制 ROC 曲線。

已建立的預(yù)后模型的臨床價(jià)值

我們分別使用單變量和多變量 Cox 回歸來測試風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和臨床特征（年齡、性別、分期）是否是黑色素瘤患者的有效預(yù)后指標(biāo)。列線圖用于展示有關(guān) 1、3 和 5 年生存率的臨床特征和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。

免疫檢查點(diǎn)與M6A-甲基化的相關(guān)性分析

然后，我們通過閱讀已發(fā)表的文獻(xiàn)收集了 47 個(gè)免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因 (ICP) 和 25 個(gè) M6A 甲基化相關(guān)基因，并在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中研究了這些基因在高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)人群中的表達(dá)。保留差異表達(dá)的ICP和ICD基因（P <0.05）并顯示為條形圖。組間比較采用秩和檢驗(yàn)。

預(yù)測黑色素瘤潛在候選藥物的模型

通過使用“pRRophetic”包和黑色素瘤患者的表達(dá)矩陣，我們預(yù)測了黑色素瘤患者藥物的最低藥物抑制濃度（IC50），最終得到了一些與模型相關(guān)的可能成為治療黑色素瘤候選藥物的藥物。黑色素瘤。

基因集富集分析

基因集富集分析(GSEA) 是一種計(jì)算方法，可確定先驗(yàn)定義的基因集是否在兩種生物狀態(tài)（例如表型）之間顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的一致差異。我們使用 GSEA 分析來探索高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組之間基因功能的 KEGG 途徑差異。