研究結(jié)果

1、病理及生化指標(biāo)

急性毒性實(shí)驗(yàn)中，14 d內(nèi)所有劑量均未觀察到小鼠死亡或異常毒性癥狀且大體解剖未見(jiàn)明顯病理改變。2g/kg劑量反復(fù)給藥7天后，組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)給藥組肝細(xì)胞腫脹，肝竇輕度擴(kuò)張，少量微肉芽腫，肝細(xì)胞輕度變性/壞死等改變，血清生化分析顯示，血清AST活性和TBIL含量顯著升高，ALT和ALP活性水平呈上升趨勢(shì)(圖1)。

圖1 | PM-D給藥后小鼠病理及生化指標(biāo)變化

2、毒性物質(zhì)的定量檢測(cè)

PM-D中蒽醌類(lèi)化合物大黃素和大黃素-8-β-D-葡萄糖苷的含量分別為3,989.820 μg/g和12,677.423 μg/g (圖2)。反式-大黃素-大黃素二蒽酮和順式-大黃素-大黃素二蒽酮含量分別為1,847.708 μg/g和1,455.940 μg/g（圖3）。

圖2 | HPLC譜圖

標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和樣品溶液(B), 大黃素-8-β-D-葡萄糖苷(1)和大黃素(2)

圖3 | MS譜圖

標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和樣品溶液(B), 反式-大黃素-大黃素二蒽酮(1)和順式-大黃素-大黃素二蒽酮(2)。

3、網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)分析

3.1PM-D肝毒性靶點(diǎn)和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

經(jīng)藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和疾病靶點(diǎn)收集共獲得了30個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果顯示mTOR、PIK3CA、AKT1、EGFR、ERBB2、ESR1、RPS6KB1、CTNNB1是核心的相關(guān)靶點(diǎn)（圖4）。

圖4 | 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及靶點(diǎn)分析

（A）共同靶標(biāo)集合

（B）藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

（C）PPI網(wǎng)絡(luò)。

3.2 GO和KEGG富集結(jié)果分析

GO富集結(jié)果主要集中在生物過(guò)程中，涉及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控、TOR信號(hào)、對(duì)外來(lái)生物刺激的響應(yīng)、細(xì)胞對(duì)內(nèi)源性刺激的反應(yīng)、激酶活性的正向調(diào)節(jié)、MAPK級(jí)聯(lián)調(diào)控、凋亡過(guò)程的調(diào)控、活性氧代謝過(guò)程的調(diào)控等（圖5A）。KEGG的富集信號(hào)通路主要包括PI3K-Akt信號(hào)通路、ERBB信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、肝細(xì)胞癌、HIF-1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路及MAPK信號(hào)通路等（圖5B）。

圖5 | GO富集分析（A）和KEGG富集分析（B）

3.3分子對(duì)接

分子對(duì)接結(jié)果顯示大部分核心毒性成分都能與靶點(diǎn)緊密結(jié)合，二蒽酮類(lèi)化合物順式-大黃素-大黃素二蒽酮（Cis-emodin-emodin dianthrones），反式-大黃素-大黃素二蒽酮（Trans-emodin-emodin dianthrones），Polygonumnolide C4相較于其他成分結(jié)合能更低。

圖6 |?PM-D中成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接分析

（A）結(jié)合能熱圖分析；（B-D）結(jié)合構(gòu)象可視化：

（B）反式-大黃素-大黃素二蒽酮- mTOR；

（C）反式-大黃素-大黃素二蒽酮- EGFR;?

（D）Polygonumnolide C4- mTOR。

4.質(zhì)譜成像分析

4.1高分辨、高覆蓋、高靈敏的代謝物成像

質(zhì)譜成像在單個(gè)像素點(diǎn)提取的代謝物峰可達(dá)數(shù)萬(wàn)種，覆蓋了豐富的代謝物。作者發(fā)現(xiàn)兩種含量較高的藥物成分大黃素和大黃酸相關(guān)代謝產(chǎn)物僅在藥物組的肝臟中高度富集。內(nèi)源性代謝物精氨酸和?；悄懰岬确植季哂袇^(qū)域特異性（圖7）。

圖7 |?AFADESI-MSI可視化PM-D給藥后代謝物變化 （A）負(fù)離子模式下平均質(zhì)譜

（B-E）內(nèi)外源性化合物的空間可視化：大黃素（B）, 大黃酚（C），精氨酸（D），?；悄懰峒芭；侨パ跄懰幔‥）。

4.2代謝輪廓分析及差異代謝物鑒定

差異代謝物經(jīng)過(guò)MS/MS鑒定，并采用MassImager軟件可視化其空間分布特征，代表性差異代謝物的質(zhì)譜圖像如圖8所示, 可觀察到精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、脯氨酸、?；撬犷?lèi)和肉堿類(lèi)代謝物顯著上調(diào)，部分脂質(zhì)類(lèi)代謝物顯著下調(diào)。

圖8 |?代表性差異代謝物質(zhì)譜成像圖

4.3通路富集分析

基于通路富集的結(jié)果，構(gòu)建了包括已鑒定的關(guān)鍵生物標(biāo)志物在內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)，揭示了膽汁酸合成、嘌呤代謝、脂肪酸氧化、三羧酸（TCA）循環(huán)和脂質(zhì)代謝等參與了PM-D致肝毒性過(guò)程的代謝變化（圖9）。

圖9 | 代謝網(wǎng)絡(luò)分析

研究討論

本研究首次應(yīng)用質(zhì)譜成像技術(shù)可視化PM-D中關(guān)鍵代謝物在肝臟中的分布并首次對(duì)PM中毒性成分二蒽酮類(lèi)化合物進(jìn)行定量檢測(cè)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測(cè)潛在毒性靶標(biāo)為何首烏毒性物質(zhì)基礎(chǔ)研究及潛在肝毒性靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)奠定了新的基礎(chǔ)。

空間分辨代謝組學(xué)進(jìn)一步挖掘出何首烏D組分的肝毒性生物標(biāo)志物，包括氨基酸、酰基肉堿、膽汁酸、脂類(lèi)等。基因富集和代謝網(wǎng)絡(luò)綜合分析表明，何首烏D組分的毒性機(jī)制可能涉及氧化應(yīng)激、線粒體損傷和AMPK通路等導(dǎo)致的膽汁酸代謝、能量循環(huán)、嘌呤代謝和脂質(zhì)代謝的紊亂相關(guān)，該研究有望為臨床診斷和監(jiān)測(cè)何首烏肝毒性的發(fā)生發(fā)展提供參考，并作為代謝適應(yīng)和重編程的資源，以指導(dǎo)未來(lái)臨床預(yù)后研究，為探索中藥毒性機(jī)制提供新思路。

歡迎百度搜索鹿明生物——訪問(wèn)鹿明生物官網(wǎng)——了解更多質(zhì)譜成像、空間代謝組學(xué)、多組學(xué)技術(shù)

猜你還想看

1、Cell 新作｜大豆中異黃酮可通過(guò)抑制血漿炎癥標(biāo)志物減輕大麻引起的血管炎癥

2、Cell新進(jìn)展！人乳腺癌腫瘤及免疫生態(tài)系統(tǒng)的單細(xì)胞圖譜

3、Nature | 腸腦軸：16S+代謝+轉(zhuǎn)錄揭示間歇性禁食改變腸道菌群，促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)

4、8月“穩(wěn)” | 恭喜鹿明生物蛋白代謝16篇項(xiàng)目文章發(fā)表，總IF:100+

本文系鹿明生物原創(chuàng)

轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明本文轉(zhuǎn)自鹿明生物