一、食品中大腸菌群，糞便大腸菌群和大腸桿菌的測試實(shí)驗(yàn)介紹

1、大腸桿菌的檢測技術(shù)可適用于食品中大腸菌群，糞便大腸菌群和大腸桿菌的測試。

2、大腸桿菌的檢測技術(shù)也可適用于航空食品檢驗(yàn)。

二、大腸桿菌的測試實(shí)驗(yàn)的試劑

1、移液器（1ml，10ml），恒溫培養(yǎng)箱（36±1℃，44.5±0.5℃），冰箱，勻漿器，振蕩器，培養(yǎng)皿，替換瓶，天平，顯微鏡等。

2、培養(yǎng)基和試劑

十二烷基硫酸鹽磷脂蛋白（LST）肉湯，亮綠色乳糖膽鹽（BGLB）肉湯，EC肉湯，曙紅藍(lán)瓊脂（EMB），營養(yǎng)瓊脂斜面，色氨酸肉湯，MR-PV培養(yǎng)基，科瑟檸檬酸鹽肉湯，結(jié)晶紫中性紅膽汁鹽瓊脂（VRBA），巴特菲爾德（Butterfield）的磷酸鹽緩沖液替代品，生理鹽水，革蘭氏染色溶液，科瓦奇（Kovacs）的衍生物或試劑，堿紅色指示劑，Voges-proskauer（VP）試劑。

序號 產(chǎn)品 貨號 CAS號 備注

1 1000ul吸頭 FT-1000-H

2 10ml寬口吸頭 FT-10000K

3 10ml窄口吸頭 FT-10000Z

4 雙料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST） PYJH50625

5 煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯 PYJH50387

6 EC肉湯 PYJH50073

7 伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB） PYJH51848

8 營養(yǎng)瓊脂 PYJH51818

9 色氨酸肉湯 PYJH50987

10 MR- PV培養(yǎng)基

11 Korser氏枸掾酸鹽肉湯

12 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA） PYJH50078

13 Butterfield氏磷酸鹽緩沖替代液

14 生理鹽水 FS0033 7732-18-5

15 革蘭氏染色液 HC0448

16 Kovacs氏衍生物

17 甲基紅指示劑 FF0001 493-52-7

18 Voges-proskauer（VP）試劑 PYJH51610

以上是實(shí)驗(yàn)采用的試劑，請采用高品質(zhì)的范德生物的生化試劑。

三、大腸桿菌的測試實(shí)驗(yàn)樣品制備

1、樣品制備：無菌采集所需樣本，并將其放入無菌容器中。如果已包裝，請使用75％的乙醇擦拭包裝的開口并取樣。

2、樣品勻漿的制備：無菌操作取25g樣品，加到225ml替代品的無菌均質(zhì)杯中，以8000r / min均質(zhì)1-2min，以1:10均質(zhì)。如果樣品的均質(zhì)時間超過2分鐘，則應(yīng)在均質(zhì)杯中加冰水冷卻。

3、稀釋樣品勻漿：使用10ml無菌吸管準(zhǔn)確吸取10ml 1:10均質(zhì)的樣品溶液，并將其放入150ml的90ml替換劑替換瓶中。快速搖動并混合樣品以制成1：100的樣品溶液。

四、食品中大腸菌群的測定

①大腸菌群MPN值的測定

1、對于每個樣品，選擇具有三個連續(xù)更換度的合適樣品更換溶液。為每個取代度混合三支月桂基硫酸微蛋白每月（LST）肉湯試管，并向每支試管中注入1ml。

2、將植入管在36±1℃下放置48±2h。

3、觀察試管的氣體產(chǎn)生情況：檢查倒試管中是否有氣泡，并記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)生氣體的LST肉湯管的數(shù)量。如果所有LST肉湯管均未產(chǎn)生氣體，則可將其報(bào)告為大腸菌陰性。如果有氣體發(fā)生，則需要進(jìn)一步的確認(rèn)測試。

②大腸菌的確證試驗(yàn)

1、將所有直徑為3mm的氣管插管移植到鮮綠色乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中。

2、將BGLB肉湯管置于36±1℃，孵育48±2h。

3、記錄所有BGLB肉湯管的氣管管數(shù)。

4、結(jié)果報(bào)告：根據(jù)BGLB肉湯產(chǎn)生的氣管數(shù)量，檢查MPN表以報(bào)告大腸菌群每克（ml）的MPN值。

五、糞便大腸菌群的測定

1、用植入環(huán)將所有產(chǎn)氣LST肉湯管培養(yǎng)物移植到EC肉湯管中。

2、在30分鐘內(nèi)將所有植入的EC肉湯管放入44.5±0.5℃水浴中，孵育24±2h。水浴液位應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基的液位。已知在44.5℃時對氣體呈陽性的大腸桿菌和在44.5℃時的產(chǎn)氣腸桿菌或其他大腸菌可作為陽性和陰性對照。

3、記錄EC肉湯管的產(chǎn)氣量。氣管試管中糞便大腸菌群呈陽性。非生產(chǎn)管經(jīng)檢測糞便大腸菌呈陰性。

4、結(jié)果報(bào)告：根據(jù)氣管數(shù)量，檢查MPN表并報(bào)告每克樣品中大腸菌群的MPN值。

六、大腸桿菌的測試實(shí)驗(yàn)測定

1、繼續(xù)將第6.3條中的EC肉湯管培養(yǎng)24小時，并將氣管試管的培養(yǎng)物條紋成曙紅亞甲基藍(lán)（EMB）板，在36±1℃下培養(yǎng)24±2h。

2、檢查平板上是否有典型的帶有黑色中心光澤或亞光的菌落。

3、如果有典型的菌落，請從每個培養(yǎng)皿中至少選擇2個典型的菌落。如果沒有典型的菌落，則從每個培養(yǎng)皿中至少選擇2個可疑菌落。用植入針觸及菌落中心，移植到營養(yǎng)瓊脂斜面上，在36±1℃下孵育18-24h。

4、將傾斜培養(yǎng)物移植到以下培養(yǎng)基中進(jìn)行生化測試。

①色氨酸肉湯：在36±1℃下孵育24±2h后，加入0.2-0.3ml的Kovacs試劑，上層顯示為紅色，為多陽離子反應(yīng)。

②MR-VP培養(yǎng)基：36±1℃培養(yǎng)48±2h。將1ml培養(yǎng)物無菌轉(zhuǎn)移到13mm * 100mm試管中，加入0.6ml 5％萘酚乙醇溶液，0.2ml 40％氫氧化鉀溶液和少量肌酸晶體，搖動試管，靜置2h，如果出現(xiàn)，則紅色為VP測試的正極。

再將MR-VP培養(yǎng)物的其余部分孵育48小時，然后加入5滴甲基紅溶液。如果培養(yǎng)物變?yōu)榧t色，則甲基紅測試為陽性，如果其變?yōu)辄S色，則為陰性。

③寇瑟檸檬酸鹽鹽酸鹽肉湯：記錄在36±1℃下生長96h。

④ LST肉湯：在36±1°C下孵育48±2h，并觀察試管中是否產(chǎn)生氣體。

⑤革蘭氏染色：采取18h營養(yǎng)瓊脂傾斜培養(yǎng)進(jìn)行革蘭氏染色。大腸桿菌是革蘭氏陰性的。

⑥大腸桿菌和非抗生素的生化鑒定如下

上表以外還有其他生化反應(yīng)類型，則表明培養(yǎng)物可能不純，應(yīng)重新劃線和分離，必要時重復(fù)測試。

⑦結(jié)果報(bào)告：大腸桿菌是革蘭氏陰性桿菌，發(fā)酵乳糖產(chǎn)生酸和氣體，IMViC測試是++-或-+-，然后根據(jù)LST肉湯陽性試管的數(shù)量檢查MPN表并報(bào)告每克（ml）樣品中大腸桿菌的MPN值。

注：本文參照SN0169-92《出口食品中大腸菌群，糞便大腸菌群和大腸桿菌的測試方法》