細胞外囊泡（EVs）是細胞間通訊的重要載體，在尿液、血漿等體液中普遍存在。EVs包含蛋白、磷酸化蛋白等多種物質，參與到腫瘤等疾病發(fā)生過程，因此，EVs的高效分離及分析在標志物篩選和疾病診斷方面具有巨大的潛力。目前，傳統(tǒng)EVs分離（如離心法、試劑盒法）各有缺陷，如耗時長、回收率差等，限制了其廣泛應用，故需要一種快速、高效的細胞外囊泡分離方法。

2021年1月，美國普渡大學陶緯國教授研究團隊在ACS Appl Mater Interfaces（IF 8.758）雜志上發(fā)表題為“Synergistically Bifunctional Paramagnetic Separation Enables Efficient Isolation of Urine Extracellular Vesicles and Downstream Phosphoproteomic Analysis”的研究成果，該研究基于新優(yōu)化的分離方法——功能化磁珠法，高效地從尿液中分離出細胞外囊泡，該方法具有低污染、高回收率（>80%）以及分離時間短（<1h）等優(yōu)點。同時，結合4D-蛋白質組、4D-磷酸化蛋白質組等新技術對前列腺癌患者和健康個體尿液外囊泡分析，找到一系列疾病相關的磷酸化蛋白質，表明其在臨床研究中的巨大應用潛力。

研究材料：10例前列腺癌患者和10例健康人的尿液樣本

技術方法：細胞外囊泡分離、4D-蛋白質組、4D-磷酸化蛋白質組

實驗路線圖：

步驟1：雙功能磁珠BiMBs制備和EVs表征

步驟2：不同EVs分離方法比較分析

步驟3：尿液細胞外囊泡全蛋白質組分析

步驟4：前列腺癌尿液外囊泡磷酸化蛋白質組分析

研究結果：

1、 BiMBs制備和EVs表征分析

研究人員開發(fā)出一種新型的EVs分離磁珠：雙功能磁珠BiMBs。為研究其分離效率，研究者對3種類型磁珠分離的EVs進行分析檢測：僅Ti(IV)固定的磁珠（TiMBs），僅用DSPE固定的磁珠（DspeMBs）以及同時用Ti(IV)和DSPE固定的功能磁珠（BiBMs）。

通過透射電鏡、納米粒子跟蹤分析技術（NTA）和蛋白質免疫印跡（WB） 等技術手段對分離的EVs的結構、粒徑、EVs標志分子（CD9、CD63）進行分析。結果顯示，從BiBMs磁珠洗脫的EVs具有完整膜結構，平均粒徑為125.7nm，且膜結構上表達CD9、CD63蛋白。

2、不同細胞外囊泡分離方法效率評估

為了與傳統(tǒng)EVs分離方法（超速離心法、UC）進行比較，研究人員通過WB檢測EVs的標志分子CD9表達強度。結果顯示，BiMBs方法表現(xiàn)出最高的分離效率，CD9表達強度分別為：BiMBs (81%) > TiMBs (69%) > DspeMBs(61%) > UC (30%)。TiMBs和DspeMBs都是基于化學親和原理捕獲EVs，相較UC方法具有更高的分離效率，而BiMBs可進一步提高分離效率，可能是由于兩個官能團的協(xié)同作用。

3、EVs全蛋白質組比較分析

研究人員進一步應用4D-蛋白質組技術對不同分離方法獲得的尿液EVs的全蛋白表達進行分析，BiBMs分離的EVs鑒定到36262條特有肽段，對應3302種特有蛋白。為所有方法中鑒定量最高。將BiBMs分離鑒定到的蛋白質與ExoCarta上發(fā)表的前100種外泌體標志蛋白質進行比較發(fā)現(xiàn)，有95種蛋白重疊，為4種方法中與數(shù)據(jù)庫重疊度最高。為進一步評估4種方法分離EVs的選擇性，通過無標記定量方法對13種外泌體標志蛋白和3種尿液特異標志物進行定量分析，基于磁珠分離方法均表現(xiàn)出更高的信號強度，顯著優(yōu)于UC方法。

4、前列腺癌尿液EVs磷酸化蛋白質組分析

隨后，研究人員應用BiBMs分離前列腺癌患者和健康對照尿液樣本的EVs，并通過4D-磷酸化蛋白質組技術分別從前列腺癌組和健康對照組中鑒定到6823條和6726條磷酸化肽段，分別匹配1564種和1413種磷酸化蛋白質。相比健康對照組，在前列腺癌組中有121種磷酸化蛋白上調表達，103種下調表達。GO分析表明，這些上調表達的磷酸化蛋白參與的生物學過程包括信號轉導、蛋白質磷酸化；分子功能則與蛋白激酶活性有關。KEGG通路分析表明，這些磷酸化蛋白主要參與例如PI3K-Akt/AMPK信號通路、前列腺癌通路等。

小編小結：

本研究開發(fā)出一種高效且特異性好的功能化磁性納米材料（BiMBs）應用于EVs分離，通過對EVs的捕獲效率、純度、蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學的評估分析表明BiBMs的高效性及特異性。這種EVs分離策略結合4D組學技術，為無創(chuàng)生物標志物篩選提供強有力的工具，具有廣闊的臨床應用前景。

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