蛋白A殘留

蛋白A是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，它能夠特異性地結(jié)合多種免疫球蛋白的Fc區(qū)段，所以常常使用蛋白A的色譜柱來分離純化單克隆抗體。天然的蛋白A由信號序列（S）、5個IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域（E、D、A、B、C）和細(xì)胞壁附著區(qū)（X、M）組成，結(jié)構(gòu)示意圖如下：

目前大多數(shù)工程蛋白A在天然序列上進(jìn)行改造，從而提高蛋白A填料的結(jié)合能力，延長填料壽命、耐溫性和穩(wěn)定性，以提高其在暴露于苛刻條件（如原位清潔（CIP）洗脫中的堿性pH環(huán)境和IgG純化步驟中的酸性pH環(huán)境）后的耐受性[1]。例如高堿性穩(wěn)定性的MabSelect SuRe，以及更高載量的MabSelect PrismA。

但是當(dāng)應(yīng)用蛋白A親和層析進(jìn)行抗體純化時，蛋白A依然能夠從填料中析出，尤其是當(dāng)其循環(huán)使用而老化時，脫落的蛋白A容易導(dǎo)致抗體的污染，對抗體藥物的安全性和有效性具有潛在的隱患。因此國內(nèi)外監(jiān)管機(jī)構(gòu)對于蛋白A殘留出臺了一些相關(guān)規(guī)定。

國內(nèi)外法規(guī)對于蛋白A殘留的規(guī)定

《中華人民共和國藥典》2020年版第三部《人用重組單克隆抗體制品總論》3.2.4 工藝相關(guān)雜質(zhì)章節(jié)中提出“采用適宜的方法對供試品宿主蛋白質(zhì)、宿主細(xì)胞和載體DNA、蛋白A及其他工藝相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行檢測。供試品測定結(jié)果應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)?！?；以及《尼妥珠單抗注射液》3.1.3.3 蛋白質(zhì)A殘留量中提出“用酶聯(lián)免疫吸附法（通則3429）測定，蛋白質(zhì)A殘留量應(yīng)不高于蛋白質(zhì)總量的0.001%”。

關(guān)于國外，美國FDA[2]提出在定量檢測蛋白A時，應(yīng)盡可能使用高度靈敏的分析方法，并且結(jié)果應(yīng)低于該方法可檢測水平。USP130《PROTEIN A QUALITY ATTRIBUTES》表示，“在純化人用抗體時應(yīng)清除濾出的蛋白A，并相應(yīng)驗(yàn)證生產(chǎn)工藝。?基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的殘留檢測通常用于工藝開發(fā)和驗(yàn)證，以確保在蛋白A親和層析后的工藝步驟中有效去除殘留蛋白A。?此外，制造商應(yīng)通過原材料鑒定和色譜柱壽命研究，對樹脂和配體質(zhì)量有清晰的了解和記錄”。

蛋白A殘留的CQA評估

以下我們將通過既有知識，對一般情況下的蛋白A殘留對于藥物的安全性和有效性的影響評估進(jìn)行論述，并通過PQAA評估工具進(jìn)行風(fēng)險評分（評估工具在往期的文章中有過介紹，參見小奕說藥：《關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）評估（1）：蛋白質(zhì)聚集》），最終確定蛋白A殘留是否屬于CQA。需要說明的是，依據(jù)既有知識的評估結(jié)果無法替代具體產(chǎn)品的實(shí)際情況，所以這里只是一種評估演示。

1、安全性

金黃色葡萄球菌是一種主要的人類病原體，與以多形核白細(xì)胞（PMN）為主的炎癥為特征的各種類型的局部和全身感染有關(guān)。葡萄球菌經(jīng)常引起肺炎，這些臨床分離株通常有蛋白A的表達(dá)增加，這表明蛋白A可能在毒力中起作用[3]。

有研究者發(fā)現(xiàn)通過TNFR1的蛋白A信號傳導(dǎo)是金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)肺炎的主要途徑[3]。蛋白A通過激活TNFR1通路，誘導(dǎo)PMN動員清除氣道中的細(xì)菌，但代價是造成PMN相關(guān)的上皮損傷和呼吸損害。

還有研究表明[4] ，金黃色葡萄球菌蛋白A（SpA）是金黃色葡萄球菌在小鼠感染性關(guān)節(jié)炎中的毒力因子。通過分別對小鼠接種野生型菌株和SpA缺乏型菌株，發(fā)現(xiàn)相比于SpA缺乏型菌株，在野生型金黃色葡萄球菌感染的小鼠中導(dǎo)致更嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎和膿毒性死亡的疾病結(jié)果。基于蛋白A殘留具有較高的免疫原性，因此對于免疫原性評分為“7（重大）”。

Prosorba是將高度純化的蛋白A共價結(jié)合到硅膠樹脂上的一種裝置，用于體外清除血漿中IgG后回輸患者，適用于治療特發(fā)性血小板減少性紫癱和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。研究表明[5]，Prosorba柱浸出蛋白A無不良反應(yīng)。對食蟹猴的研究表明[6]，每周體內(nèi)靜脈注射高度純化的SpA 100 μg/kg的劑量后，連續(xù)12周， 食蟹猴也無明顯不良反應(yīng)。因此對于非免疫安全性評分為“1（不顯著）”。

2、有效性

如果蛋白A與抗體藥物一起存在時，預(yù)計會結(jié)合抗體的Fc結(jié)構(gòu)域，并影響藥效和藥代動力學(xué)（PK）。由于并非所有浸出的蛋白A都是完整的[7]，因此對效價的評分為“5（中等）”。

還有相關(guān)文獻(xiàn)報道[8]，SpA或其低分子量片段B可降低小鼠IgG的半衰期。Dima[8]等人提出SpA屏蔽了IgG分解代謝位點(diǎn)，損害了該位點(diǎn)的功能。將金黃色葡萄球菌放射標(biāo)記蛋白A靜脈注射小鼠和兔子體內(nèi)形成可溶的[(IgG)2-(SpA)1]2復(fù)合物。復(fù)合物在小鼠和兔子體內(nèi)的半衰期比在動物體內(nèi)相應(yīng)的游離IgG的半衰期短得多（可高達(dá)15倍）。因此對藥代動力學(xué)（PK）的評分為“5（中等）”。

3、風(fēng)險評分

綜上，依據(jù)既有知識并采用PQAA評估工具，對蛋白A殘留的最終風(fēng)險評分為7分（詳見下表），因此蛋白A殘留屬于蛋白質(zhì)藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

表1 蛋白A殘留嚴(yán)重性評分（使用PQAA評估工具）

參考文獻(xiàn)

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