2023年第26屆ASGCT于5月16日至20日在洛杉磯召開,匯聚了世界各地的基因和細(xì)胞治療專業(yè)人士，是全球最大的專業(yè)從事基因和細(xì)胞治療研究的非贏利性醫(yī)學(xué)組織，也是世界基因與細(xì)胞治療領(lǐng)域最具權(quán)威性與公信力的機(jī)構(gòu)。我們整理了在2023 ASGCT中關(guān)于circRNA領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，以饗讀者。

01

利用四膜蟲I型內(nèi)含子和細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀RNA的研究進(jìn)行端到端自剪接，高效制備環(huán)狀RNA

標(biāo)題：Efficient Circular RNA Engineering by End-to-End Self-Targeting and Splicing Reaction Using Tetrahymena Group I Intron and Study of Circular RNAs in Cells

作者：Seong-Wook Lee（韓國(guó)龍仁檀國(guó)大學(xué)）

摘要編號(hào)：540

摘要：

環(huán)狀RNA (circRNA)具有優(yōu)于線性mRNA的優(yōu)勢(shì)，作為一種新的疫苗和治療劑正獲得成功。然而，新的circRNA制備方法幾十年來一直沒有開發(fā)出來。

在這項(xiàng)研究中，我們開發(fā)了一種新的體外環(huán)狀RNA工程策略，利用四膜蟲I型內(nèi)含子核酶在體外轉(zhuǎn)錄過程中進(jìn)行端到端自靶向和剪接(STS)反應(yīng)，將沒有任何外源片段的環(huán)狀RNA提供給可能引發(fā)細(xì)胞中不必要的先天免疫反應(yīng)的環(huán)狀RNA序列。在高效自環(huán)化方面，做著對(duì)I組內(nèi)含子核酶組分進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的自環(huán)化RNA結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)提高了自環(huán)化效率，可與內(nèi)含子-外顯子排列法(PIE)相比較。此外，還優(yōu)化了上游工藝的體外轉(zhuǎn)錄條件和下游工藝的離子對(duì)反相高效液相色譜(IP-RP HPLC)純化方法。使用CVB3 IRES的IP-RP hplc純化的circRNA在HEK293A細(xì)胞中顯示出與PIE法制備circRNA相似的高效蛋白表達(dá)。此外，在A549細(xì)胞中，沒有外源片段和任何修飾的核苷酸circRNA誘導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)可以忽略不計(jì)。總之，我們新的體外制備circRNA策略可有效地在體外產(chǎn)生circRNA，并用于細(xì)胞中的蛋白表達(dá)和各種應(yīng)用。

02

circAde，一個(gè)依賴環(huán)狀RNA生物發(fā)生的剪切體的和延長(zhǎng)更有效的蛋白表達(dá)的載體系統(tǒng)

標(biāo)題：circAde, a Vector System for Spliceosome Dependent circRNA Biogenesis and Prolonged More Effective Protein Expression

作者：Thomas B. Hansen（Karolinska Institutet）

摘要編號(hào)：1095

摘要：

環(huán)狀RNA (circRNA)是一類新型的內(nèi)源性表達(dá)RNA。與mRNA相比，環(huán)狀RNA具有抵抗核外降解的能力，從而具有較高的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性和持久性。近年來，對(duì)體外內(nèi)circRNA產(chǎn)生的理解都有了顯著提高，現(xiàn)在可以設(shè)計(jì)circRNA進(jìn)行高效的蛋白質(zhì)翻譯。因此，工程化環(huán)狀RNA正在作為一種新的治療概念出現(xiàn)，它可能克服mRNA面臨的一些挑戰(zhàn)。治療性環(huán)狀RNA的生產(chǎn)可以通過兩種不同的機(jī)制實(shí)現(xiàn)，1)使用內(nèi)含子I型衍生的核酶循環(huán)進(jìn)行體外生產(chǎn)，或2)使用類似內(nèi)源性環(huán)狀RNA生物發(fā)生的基于剪接體的反剪接進(jìn)行體內(nèi)生產(chǎn)。在后一種設(shè)置中，插入側(cè)翼倒置重復(fù)(IR)元件可以通過將剪接位點(diǎn)定位在接近空間的位置來顯著刺激反向剪接。

在這里，我們展示了我們專有的circRNA表達(dá)系統(tǒng)circAde，允許通過剪接體依賴的生物發(fā)生高效circRNA生產(chǎn)。通過一組概念驗(yàn)證報(bào)告，我們發(fā)現(xiàn)某些設(shè)計(jì)特征極大地影響了circRNA的產(chǎn)生和隨后的蛋白質(zhì)表達(dá)，特別是IR和IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列)元件的選擇。研究人員查詢了公開可用的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集，以鑒定多種細(xì)胞類型中最豐富的環(huán)狀RNA側(cè)翼的IR元件。候選IRs在我們的circAde系統(tǒng)中進(jìn)行了測(cè)試，并對(duì)那些能夠刺激最高水平circRNA產(chǎn)生的IRs進(jìn)行了修飾，以進(jìn)一步提高circRNA的產(chǎn)量。由于沒有5'cap, circRNA依賴于IRESs進(jìn)行有效翻譯。令人驚訝的是，除了促進(jìn)circRNA翻譯外，我們觀察到IRES的選擇也影響了circRNA的生物發(fā)生和產(chǎn)量。通過對(duì)1000多個(gè)假設(shè)的IRES元件進(jìn)行兩個(gè)正交IRES篩選，我們已經(jīng)確定了黑色素瘤和肺癌細(xì)胞系中最有效的IRES序列，能夠高效進(jìn)行的circRNA生產(chǎn)和高產(chǎn)蛋白表達(dá)。此外，通過比較circAde和基于mRNA的載體的蛋白質(zhì)輸出，我們發(fā)現(xiàn)circAde系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)量和表達(dá)的時(shí)間可持續(xù)性方面優(yōu)于傳統(tǒng)的基于mRNA的方法。此外，circAde系統(tǒng)在選擇轉(zhuǎn)基因有效載荷和載體主干時(shí)具有高度通用性。總之，我們的研究結(jié)果為開發(fā)新的、更有效的策略來治療需要持久轉(zhuǎn)基因表達(dá)的疾病的新平臺(tái)提供了技術(shù)上的概念驗(yàn)證。

03

使用環(huán)狀RNA引導(dǎo)物來糾正膠原蛋白VI相關(guān)萎縮癥的顯性抑制甘氨酸替代的熱點(diǎn)問題

標(biāo)題：Use of Circular RNA Guides to Correct a Hotspot of Dominant-Negative Glycine Substitutions Causing Collagen VI-Related Dystrophies?

作者：Carsten G.Bonnemann（NINDS/NIH ）

摘要編號(hào)：677

摘要：

膠原蛋白VI相關(guān)營(yíng)養(yǎng)不良癥（COL6-RD）是一組先天性神經(jīng)肌肉疾病，目前尚無有效的治療方法。顯性抑制作用的致病變體，特別是保守的膠原蛋白Gly-X-Y動(dòng)點(diǎn)的甘氨酸替換，在COL6A1、COL6A2和COL6A3基因的三螺旋結(jié)構(gòu)域中很常見。由于它們?cè)谌菪Y(jié)構(gòu)域中的特殊位置，它們能夠納入膠原蛋白α1、α2和α3（VI）鏈的分級(jí)組裝，從而產(chǎn)生功能失調(diào)的膠原VI細(xì)胞外基質(zhì)。兩個(gè)最常見的Gly替代，p.G284R和p.G293R位于α1（VI）鏈中，構(gòu)成了一個(gè)顯性抑制突變的熱點(diǎn)區(qū)域。大多數(shù)甘氨酸錯(cuò)義致病變體是由單次鳥苷(G)到腺苷（A）的突變引起的，使其適用于使用內(nèi)源性腺苷脫氨酶(ADARs)的RNA編輯方法。ADARs使用雙鏈RNA作為底物來催化腺苷（A）到肌苷（I），這在翻譯過程中模擬了G。

在這里，我們研究了使用環(huán)狀A(yù)DAR募集RNA來招募內(nèi)源性ADAR酶來改變特定的A到I，作為一種治療G>A突變引起的膠原蛋白VI相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)不良癥的方法。RNA環(huán)化改善了RNA的穩(wěn)定性，增加了對(duì)細(xì)胞外切酶的抗性，從而提高了可編程RNA編輯的效率和持久性。值得注意的是，在HEK293T細(xì)胞中，攜帶p.G284R和p.G293R等位基因的熒光報(bào)告基因結(jié)果表明，使用單一的環(huán)狀A(yù)DAR募集RNA來解決這兩種變異體時(shí)，RNA編輯的百分比分別高達(dá)22%和25%。這種方法將在體內(nèi)外患者來源的成纖維細(xì)胞和正在生成的人源化小鼠模型中進(jìn)行測(cè)試。

04

環(huán)狀RNA定位于人腦突觸并在阿爾茨海默病中差異表達(dá)，暗示其在突觸功能的關(guān)鍵作用，可能為基因治療提供新的靶點(diǎn)

標(biāo)題：Circular RNAs Localize to Synapses in the Human Brain and Differentially Expressed in Alzheimer’s Disease Implicating Critical Roles for Synaptic Function Which Could Present New Targets for Gene Therapy

作者：Paul N. Valdmanis（華盛頓大學(xué)）

摘要編號(hào)：1664

摘要：

環(huán)狀RNA（circRNA）是一種獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，可能在人腦中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，對(duì)神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默?。ˋD）的發(fā)展有影響。circRNA通過前體 mRNA 的外顯子反向剪接而形成閉環(huán)結(jié)構(gòu)。除了翻譯功能之外，它們還可以發(fā)揮多種功能，包括作為microRNA和蛋白質(zhì)的 "海綿 "來調(diào)控蛋白表達(dá)。circRNA因?yàn)槟褪芎怂嵬馇忻?，能穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中。AD是最常見的癡呆形式，其分子特征是由淀粉樣β肽和過度磷酸化的tau蛋白的神經(jīng)原纖維纏結(jié)組成的斑塊逐漸積累，導(dǎo)致突觸和神經(jīng)元損失以及認(rèn)知障礙。前人的研究表明，circRNA優(yōu)先定位于突觸，許多circRNA表達(dá)在AD中受到干擾。我們使用新技術(shù)和統(tǒng)計(jì)方法添加了新的見解，從而證實(shí)這一結(jié)論，并且在此基礎(chǔ)上確定了已鑒定circRNA的功能作用。為了發(fā)現(xiàn)和量化AD腫突觸定位的RNA轉(zhuǎn)錄本，我們采集了30多個(gè)死后人腦樣本，包括AD患者和對(duì)照組。從均質(zhì)化的腦組織中，我們用蔗糖梯度超速離心法對(duì)突觸顆粒（突觸體）進(jìn)行分離。接下來，我們從突觸體部分和勻漿中提取了RNA，然后通過捕獲非典型的核糖去除總RNA的策略獲得RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。通過比較突觸體和勻漿，我們證實(shí)絕大多數(shù)的circRNA在突觸中富集。

此外，通過比較AD和對(duì)照組的突觸體，我們發(fā)現(xiàn)還有許多circRNA差異定位在AD中的突觸上，表明其作為基因治療干預(yù)的潛在靶點(diǎn)有望改善疾病。在最顯著的差異定位的circRNA中，基因GSK3B的兩種亞型最為突出。其中，一個(gè)異構(gòu)體是外顯子7、8和9形成的環(huán)，另一個(gè)異構(gòu)體是外顯子9和10形成的環(huán)。最有趣的是，前者在AD中上調(diào)，而后者在AD中下調(diào)。由于GSK3B在tau過度磷酸化中具有明確的作用，因此我們發(fā)現(xiàn)AD中有兩種獨(dú)特的GSK3B環(huán)狀亞型，它們?cè)贏D的突觸處有不同的定位。為了研究每種亞型的影響，我們?cè)赟H-Sy5y細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了含有互補(bǔ)Alu元件的circGSK3B外顯子質(zhì)粒。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染這些質(zhì)粒都會(huì)導(dǎo)致GSK3B蛋白及其磷酸化狀態(tài)的蛋白質(zhì)豐度差異，這可能與AD分子病理學(xué)有關(guān)。我們假設(shè)這些circRNA對(duì)包括tau蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)有進(jìn)一步的下游影，為通過傳遞或操縱circRNA來調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)以治療疾病提供了基礎(chǔ)。circRNA在細(xì)胞質(zhì)中的多功能作用和穩(wěn)定性，具有巨大的應(yīng)用前景。我們的工作進(jìn)一步揭示這些發(fā)現(xiàn)的意義，并且對(duì)這類分子研究提供了新見解。