免疫治療問世以后，晚期肝細(xì)胞癌（HCC）的治療觀點發(fā)生了深刻變化。與索拉非尼相比，免疫治療緩解者生存率提高，但只有1/3的患者從中顯著獲益。由于腫瘤微環(huán)境在免疫治療緩解中發(fā)揮核心作用，HCC治療的未來目標(biāo)應(yīng)該是確定易于在臨床實踐中使用的肝組織狀況的替代指標(biāo)。因此，尋找準(zhǔn)確預(yù)測預(yù)后的生物標(biāo)志物將是近期HCC治療管理的熱點。了解免疫治療耐藥機制可能會擴大受益于免疫治療的患者群體，并且?guī)椭芯咳藛T找到新的組合方案來改善患者預(yù)后。本文綜述了目前與免疫檢查點抑制劑治療相關(guān)的預(yù)后非侵入性生物標(biāo)志物的相關(guān)知識，重點為血清學(xué)標(biāo)記物和腸道微生物群。

——前 言——

HCC是高度異質(zhì)性的癌種，在既往的化療時代，鮮有藥物能夠?qū)CC產(chǎn)生療效。靶向治療時代，以索拉非尼為代表的小分子TKI藥物，成為HCC治療的標(biāo)準(zhǔn)方案，但整體患者響應(yīng)率較低，耐藥性較高，患者整體的OS提升效果有限。而在免疫治療時代，以T+A、D+T為代表的免疫聯(lián)合靶向及雙免疫聯(lián)合方案，成為新的晚期HCC一線治療標(biāo)準(zhǔn)。無論是患者客觀響應(yīng)率及OS的提升，都表現(xiàn)不俗。但依然有較大的提升空間。如何有效的篩選免疫獲益型的HCC患者，特別是非侵入性的Biomarker的探索 ，是進(jìn)一步提升患者響應(yīng)率及OS的發(fā)展方向。

HCC免疫治療的新型Biomarker

——侵入性Biomarker——

腫瘤免疫治療相關(guān)的生物標(biāo)志物譜，比較常用的還是TMB、dMMR、PD-L1，也是泛腫瘤普遍監(jiān)測的生物標(biāo)記物。

細(xì)胞程序性死亡 - 配體1（PD-L1）

PD-L1表達(dá)作為PD-1單抗直接的作用靶點，是腫瘤組織上的一個重要標(biāo)志物，也是目前研究最為深入的標(biāo)志物，但關(guān)于PD-L1表達(dá)的預(yù)測價值，在不同瘤種中，研究結(jié)論不一。由此引發(fā)了對分子生物標(biāo)志物、循環(huán)生物標(biāo)志物和影像生物標(biāo)志物的探索。

《中國非小細(xì)胞肺癌PD-L1表達(dá)檢測臨床病理專家共識》

目前常采用的平臺技術(shù)和非小細(xì)胞肺癌中不同免疫檢查點抑制劑的Cut-off值如上圖所示。SP263被歐盟批準(zhǔn)用于非小細(xì)胞肺癌帕博利珠單抗藥物一線和二線以及Ⅲ期患者度伐利尤單抗藥物的伴隨診斷、納武利尤單抗藥物二線的補充診斷；FDA批準(zhǔn)其用于非小細(xì)胞肺癌Ⅲ期患者度伐利尤單抗藥物的補充診斷；到目前為止，22C3PD-L1抗體、SP263PD-L1抗體以及 22C3、28-8?PD-L1檢測、SP142PD-L1都已經(jīng)獲得NMPA獲批。隨著試驗的不斷更迭，PD-L1的檢測指標(biāo)也由TPS向CPS轉(zhuǎn)變。

TPS

• 作為FDA批準(zhǔn)的伴隨診斷和補充診斷，PD-L1檢測關(guān)注焦點是位于腫瘤細(xì)胞的PD-L1表達(dá)水平，即 腫瘤細(xì)胞陽性比例分?jǐn)?shù)（TumorProportion Score, TPS)。

  
  

CPS

• 除了腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1之外，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞也會有PD-L1表達(dá)，從而抑制免疫功能。因此，需要引入另一個PD-L1表達(dá)概念：聯(lián)合陽性分?jǐn)?shù)（CombinedPositive Score，CPS）

  
  

帕博利珠單抗PD-L1cut-off值

據(jù)報道，PD-L1在HCC中的表達(dá)普遍較低（約占腫瘤細(xì)胞的10%），并且與復(fù)發(fā)和更短的OS相關(guān)。但在HCC領(lǐng)域，應(yīng)用有限。

腫瘤突變負(fù)荷（TumorMutation Burden, TMB）

預(yù)測新抗原數(shù)量的指標(biāo),突變負(fù)荷提高會產(chǎn)生更多MHC結(jié)合和免疫原性肽，TMB被定義為每百萬堿基中被檢測出的，體細(xì)胞基因編碼錯誤、堿基替換、基因插入或缺失錯誤的總數(shù)。即外顯子區(qū)域上平均1Mb堿基出現(xiàn)的體細(xì)胞突變（非同義突變）的數(shù)量。? ??

TMB與ICIs ORR的相關(guān)行?

腫瘤突變負(fù)荷（TMB）作為一個潛在的生物標(biāo)志物而出現(xiàn)。在不同的癌癥中體細(xì)胞突變的數(shù)量從0.01突變/Mb~超過400突變/Mb不等。而這些突變中有些會轉(zhuǎn)錄表達(dá)多肽抗原表位或腫瘤新抗原。早期關(guān)于TMB的研究都是采用全外顯子（WES）測序方法對腫瘤DNA和對照的胚系DNA進(jìn)行分析。

TMB閾值

然而，與PD-L1表達(dá)的情況一樣，TMB測定缺乏標(biāo)準(zhǔn)化閾值，量化方法也存在差異。因此，應(yīng)謹(jǐn)慎解釋TMB的臨床價值。

2017年，F(xiàn)DA首次基于腫瘤生物標(biāo)志物狀態(tài)（具有標(biāo)志意義），批準(zhǔn)了pembrolizumab用于治療微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高(MSI-H)或錯配修復(fù)缺陷(dMMR)不可切除/轉(zhuǎn)移性實體腫瘤的患者。

從某種程度上來說，TMB的上游影響因素就是MSI，而MSI的原因又在與DNA復(fù)制時出現(xiàn)了錯誤，主要是修復(fù)蛋白MMR出現(xiàn)看功能障礙，因此，我們常見到MSI-H/dMMR同時成為不同癌種，尤其是結(jié)直腸癌的檢驗指標(biāo)。接下來，我們具體介紹各個名詞概念。

在介紹MSI之前，首先我們得了解微衛(wèi)星等概念。

微衛(wèi)星（Microsatellite，MS）

• 基因組中的一類短串聯(lián)重復(fù)DNA序列，一般由1-6個核苷酸組成，呈串聯(lián)重復(fù)排列。由于其核心重復(fù)單元重復(fù)次數(shù)差異，微衛(wèi)星具有群體多態(tài)性。

微衛(wèi)星穩(wěn)定（Microsatellite stability，MSS）(

• 指與正常組織相比，在腫瘤中某一微衛(wèi)星的重復(fù)單位沒有插入或缺失的改變，該微衛(wèi)星是穩(wěn)定的狀態(tài)。i

微衛(wèi)星不穩(wěn)定（Microsatellite Instability，MSI）(t

• 與正常組織相比，腫瘤中某個微衛(wèi)星位點由于重復(fù)單元的插入或缺失而出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因的現(xiàn)象。

• 原因：人體細(xì)胞內(nèi)微衛(wèi)星錯配修復(fù)系統(tǒng)(MMR)功能失常，導(dǎo)致DNA復(fù)制發(fā) 生錯誤，導(dǎo)致腫瘤部位遺傳物質(zhì)發(fā)生改變。

• 結(jié)果：MSI會使正常細(xì)胞向惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。根據(jù)不同的穩(wěn)定程度，分為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H）、中度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-M）、低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-L）。

  
  

dMMR與免疫治療

錯配修復(fù)（Mismatch Repair ，MMR）

• MMR是重要的DNA修復(fù)機制，是識別及修復(fù)在DNA復(fù)制或重組過程中，可能產(chǎn)生的堿基錯誤插入、缺失和錯配以及其他形式的DNA損傷，維持基因組穩(wěn)定性。

• 在人體內(nèi)，7個MMR蛋白（MLH1、MLH3、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1和PMS2）按照工作順序進(jìn)行DNA? 的修復(fù)

錯配修復(fù)缺陷（Mismatch Repair Deficiency，dMMR）

• MMR缺陷，即DNA錯配修復(fù)功能缺陷，MMR蛋白表達(dá)陰性。MMR功能缺陷與多種腫瘤相關(guān)，尤其是與遺傳學(xué)非息肉性大腸癌、部分散發(fā)性大腸癌及Lynch綜合征。i

  
  

dMMR的表達(dá)情況?

雖然MSI-H病例在整個腫瘤譜中發(fā)生的頻率較低，但它們在結(jié)直腸癌(CRC)和子宮內(nèi)膜癌中最為普遍，頻率約為15%（在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中為5%）。

MSI/MMR監(jiān)測

為了確定MSI/MMR狀態(tài)，通常首先使用IHC對四種MMR蛋白，MSH2、MSH6、MLH1和PMS2進(jìn)行評估，如果這些蛋白沒有通過IHC檢測到，CRC被歸類為錯配修復(fù)缺陷(dMMR)。由于MMR在DNA復(fù)制過程中的功能錯誤，可以導(dǎo)致MSI。

MSI/MMR的檢測方法

針對PD-L1、TMB、MSI-H/dMMR等標(biāo)志物進(jìn)行了相關(guān)性分析，?采用PD-L1 IHC CDx測定PD-L1、FoundationOne?CDx測定TMB、FoundationOne?CGP測定MSI。

PD-L1cut-off值：

??? 非小細(xì)胞肺癌（TPS）≥ 1）

??? 食管鱗狀細(xì)胞癌（CPS）≥10)

???? 尿路上皮癌（CPS）≥10)

???? 宮頸癌（CPS）≥10)

???? 胃/胃食管腺癌（CSP）≥1)

???? 頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（CSP）≥1)

???? 乳腺癌(IC)≥1）

TMB/MSI cut-off值：

?????? ≥10個mutations/Mb

?????? MSI+ = MSI-H

圖16.PD-L1/MSI/MMR的關(guān)系

測定了22592例多癌種患者中PD-L1/TMB/MSI的關(guān)系，兩個以上Biomarker陽性的患者人群數(shù)量占比較高，也體現(xiàn)出聯(lián)合檢測指標(biāo)在臨床患者中的重要性。不同腫瘤中PD-L1陽性、TMB-H、MSI-H擴增的發(fā)生率差異大，當(dāng)這些標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測，可有效篩查出免疫治療潛在獲益人群。然而，這些相對可靠的生物標(biāo)志物在實際臨床應(yīng)用中仍面臨挑戰(zhàn)，如在不同平臺間檢測PD-L1表達(dá)水平的一致性欠佳，TMB檢測方法、閾值及算法仍無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，MSI-H在泛癌癥中發(fā)生率并不高等。此外，一些新的潛在生物標(biāo)記物，如HLA分型、TILs（腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞）、腸道微生物等仍需更多的研究證據(jù)支持。

——非侵入性Biomarker——

研究表明，TGF-β在TME內(nèi)的免疫抑制和腫瘤免疫逃避中起著核心作用。在HCC中，TGF-β信號與耗竭的免疫信號之間存在強烈的相關(guān)性。在一項II期試驗中，對29例接受pembrolizumab治療的不可切除肝癌患者的幾種代表性循環(huán)生物標(biāo)志物進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，基線血漿TGF-β水平<200 pg/mL是更好的OS和PFS的有效預(yù)測因子。

一些可溶性免疫檢查點相關(guān)蛋白最近被證明在各種癌癥類型中具有很好的預(yù)測價值。如PD-L1的外泌體，在一項研究中，循環(huán)外泌體PD-L1水平的增加幅度可以區(qū)分臨床應(yīng)答者和無應(yīng)答者。此外，可溶性PD-L1（sPD-L1）與NSCLC患者的免疫治療反應(yīng)相關(guān)，而關(guān)于HCC患者缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)，需要進(jìn)一步研究。

外周血中的循環(huán)免疫細(xì)胞已被廣泛評估為預(yù)測性生物標(biāo)記物。在tremelimumab對HCC患者與局部區(qū)域治療的聯(lián)合試驗中，發(fā)現(xiàn)在基線檢查時，外周血單個核細(xì)胞中CD4+PD-1+細(xì)胞的頻率在對治療有反應(yīng)的患者中高于無反應(yīng)的患者。此外，在16例接受nivolumab治療的肝癌患者中，觀察到基線水平較低的外周血PD-1+B細(xì)胞陽性和PD-L1+單核細(xì)胞陽性與疾病控制相關(guān)。

循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）可以預(yù)測幾種腫瘤對ICI治療的反應(yīng)。然而，一項使用ctDNA分析晚期HCC突變情況的研究報告，WNT通路相關(guān)突變與ICI治療后的臨床結(jié)果無關(guān)，表明需要進(jìn)一步研究以確定ctDNA是否確實可以作為HCC的預(yù)測性生物標(biāo)記物。

高甲胎蛋白（AFP）水平被認(rèn)為是肝癌患者臨床預(yù)后不良的一個預(yù)后標(biāo)志物。最近，據(jù)報道，治療后血清AFP水平下降與晚期HCC更好的ICI治療效果有關(guān)。然而，checkmate040臨床試驗的結(jié)果表明，盡管基線AFP<400μg/L比AFP≥400μg/L與更長的OS相關(guān)，但無論基線AFP水平如何，ORR和DCR相似。鑒于AFP水平與患者的基線特征密切相關(guān)，應(yīng)謹(jǐn)慎解釋其預(yù)測效果。

外周血中的生物標(biāo)記物具有低侵入性的巨大優(yōu)勢，同時大量研究也顯示了其作為免疫治療效果預(yù)測因子的潛力。然而，仍然缺乏來自大樣本臨床試驗的支持性數(shù)據(jù)。此外，目前還沒有證據(jù)表明，對于任何給定的生物標(biāo)記物，血液樣本的預(yù)測準(zhǔn)確性優(yōu)于組織樣本。

越來越多的證據(jù)表明，腸道微生物群在先天性和適應(yīng)性免疫的發(fā)展和調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群與ICI治療反應(yīng)之間似乎存在一定的關(guān)系。

Zheng等人最近通過宏基因組測序報告了肝癌抗PD-1免疫治療期間腸道微生物組組成的動態(tài)變化。他們觀察到，與無應(yīng)答者相比，免疫治療應(yīng)答者的糞便樣本顯示出更高的分類豐富度和更多的基因計數(shù)，反應(yīng)組的微生物組成保持相對穩(wěn)定，而無反應(yīng)組的變形菌數(shù)量從第3周開始顯著增加，并在第12周占優(yōu)勢。此外，據(jù)報道，ICI治療開始時使用抗生素與更差的結(jié)果相關(guān)，表明腸道微生物群對HCC治療的影響。目前正在進(jìn)行一項臨床試驗（NCT03785210），以評估聯(lián)合抗生素（萬古霉素）和ICI療法的療效。

參考文獻(xiàn)

1. Pallozzi M, et al. Non-Invasive Biomarkers for Immunotherapy in Patients with Hepatocellular Carcinoma: Current Knowledge and Future Perspectives. Cancers (Basel). 2022 Sep 23;14(19):4631. doi: 10.3390/cancers14194631. PMID: 36230554; PMCID: PMC9559710.

2.?Biomarkers and Future Perspectives forHepatocellular Carcinoma Immunotherapy. Front Oncol.?2021; 11: 716844.