1.?百螢Annexin V，PacBlue綴合物簡介以及作用

? ? ? Annexin V，PacBlue綴合物是美國AAT Bioquest研發(fā)的用于檢測細(xì)胞功能的探針，膜聯(lián)蛋白是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族。 它們富含真核生物，屬于參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的普遍存在的細(xì)胞質(zhì)蛋白家族。 膜聯(lián)蛋白V的優(yōu)先結(jié)合配偶體是磷脂酰絲氨酸（PS），其通常保持在細(xì)胞膜的內(nèi)葉（細(xì)胞質(zhì)側(cè)）。 在細(xì)胞凋亡中，PS被轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜的外部小葉。 磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞表面上的出現(xiàn)是細(xì)胞凋亡的初始/中間階段的通用指示，并且可以在觀察到形態(tài)變化之前檢測到。 我們的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物是一組監(jiān)測細(xì)胞功能的工具，旨在通過測量磷脂酰絲氨酸的易位來監(jiān)測細(xì)胞凋亡。

? ? ? ?膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物在Ca2+存在下與凋亡細(xì)胞表面上的PS結(jié)合，它也可以通過壞死細(xì)胞膜或死細(xì)胞并與細(xì)胞內(nèi)部的PS結(jié)合。 因此，我們建議將細(xì)胞不可滲透的核染色與膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物結(jié)合使用，以區(qū)分死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。

2.?百螢Annexin V，PacBlue綴合物參數(shù)

分 子 量 ?????～36000

溶? ? ??劑 ?????Water

存儲條件 ?????在零下15度以下保存，避免光照

規(guī)? ? ? ?格 ????100 tests?

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3.?百螢Annexin V，PacBlue綴合物實驗方案

方案概述：

用測試化合物（200μL/樣品）制備細(xì)胞

添加Annexin V結(jié)合物測定溶液

室溫孵育30-60分鐘

用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析

具體實驗步驟

(1)用膜聯(lián)蛋白V綴合物制備和孵育細(xì)胞：

A.制備膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl2，pH 7.4。

B.用測試化合物處理細(xì)胞一段所需的時間（用星形孢菌素處理的Jurkat細(xì)胞4-6小時）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

C.離心細(xì)胞，得到1-5×105個細(xì)胞/管。

D.將細(xì)胞重懸于200μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液中（來自步驟A）。

E.在細(xì)胞中加入2μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物。

可選：在細(xì)胞內(nèi)加入死細(xì)胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細(xì)胞。

F.在室溫下孵育30至60分鐘，避光。

G.在用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析細(xì)胞之前，加入300μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟A）以增加體積（參見下面的步驟H）。

H.使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測熒光強度（參見下面的步驟(2)或(3)）。

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(2)使用流式細(xì)胞儀分析：

通過使用具有適當(dāng)過濾器的流式細(xì)胞儀來量化膜聯(lián)蛋白V綴合物。

注意：粘附細(xì)胞上的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測，因為在細(xì)胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。 然而，Casiola-Rosen等人先前報道了利用膜聯(lián)蛋白V對貼壁細(xì)胞類型進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的方法。 和van Engelend等人（見參考文獻(xiàn)1和2）。

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(3)使用熒光顯微鏡分析：

A.移取步驟(1)F的細(xì)胞懸液，用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟(1)A）沖洗1-2次，然后用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟(1)A）重懸細(xì)胞。 將細(xì)胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。

注意：對于粘附細(xì)胞，建議直接在蓋玻片上生長細(xì)胞。 與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育（步驟(1)F）后，用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟(1)A）沖洗1-2次，并將膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟(1)A）加回到蓋玻片中。 在玻璃載玻片上翻轉(zhuǎn)蓋玻片并觀察細(xì)胞。 在與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育后，細(xì)胞也可以在2％甲醛中固定，并在顯微鏡下觀察。

B.在熒光顯微鏡下用適當(dāng)?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白V綴合物的凋亡細(xì)胞

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4.參考文獻(xiàn)

White light-induced cell apoptosis by a conjugated polyelectrolyte through singlet oxygen generation
Authors:?Jiamei Liang, Pan Wu, Chunyan Tan, Yuyang Jiang
Journal:?RSC advances (2018): 9218--9222

Resources-Application Notes Phenotypic and Epigenetic Mechanism of Action Determinations of Histone Methylase and Demethylase Inhibitors using Digital Widefield Microscopy
Authors:?Brad Larson, Peter Banks
Journal:?Experimental Biology (2017)

Targeted Magnetic Intra-Lysosomal Hyperthermia produces lysosomal reactive oxygen species and causes Caspase-1 dependent cell death
Authors:?Pascal Clerc, Pauline Jeanjean, Nicolas Halalli, Michel Gougeon, Bernard Pipy, Julian Carrey, Daniel Fourmy, Véronique Gigoux
Journal:?Journal of Controlled Release (2017)

Detecting Apoptosis, Autophagy, and Necrosis
Authors:?Jack Coleman, Rui Liu, Kathy Wang, Arun Kumar
Journal:?(2016): 77--92