人類基因組DNA核苷酸序列中約93％能被轉(zhuǎn)錄為RNA,其中僅2％的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被翻譯為蛋白質(zhì), 余下98％屬于非編碼RNA(ncRNA)。 隨著microRNA的研究進展,揭示了ncRNA在人類基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、細胞生長、分化、增殖中起著相當(dāng)重要的作用。ncRNA的研究熱度最高的主要是microRNA、circRNA、lncRNA。近年來，越來越多科研學(xué)者投身非編碼RNA的研究中，且碩果累累，以下是自2018年以來各種非編碼RNA相關(guān)的文章發(fā)表數(shù)目和國自然基金數(shù)目：

研究非編碼RNA功能的方法有哪些？該如何選擇？

對非編碼RNA的研究，可以從功能獲得性和功能缺失性進行驗證。過表達、RNA模擬物、RNA激動劑可以進行功能獲得性驗證。對于功能缺失性研究，目前常用的方法有RNAi、RNA抑制劑、拮抗劑、反義寡核苷酸（ASO）、啟動子敲除、基因敲除等。

1）RNAi沉默非編碼RNA的效果較差，甚至無法干擾某些circRNA和lncRNA。因為RNA干擾在轉(zhuǎn)錄后水平起作用的，也就是說RNA要被干擾就要定位在胞漿中，但是，lncRNA是選擇性分布在核內(nèi)和胞質(zhì)中的，circRNA也有部分定位在細胞核中。因此，傳統(tǒng)用于mRNA功能缺失研究的siRNA和shRNA工具不適合lncRNA和circRNA功能缺失性研究。此外，RNAi的脫靶效率極高，容易造成對RNA功能的誤判。
2）RNA抑制劑、拮抗劑由于活性和穩(wěn)定性的限制，不易通過細胞膜。此外，這兩種方法主要應(yīng)用于microRNA的研究，均無法應(yīng)用在circRNA和lncRNA研究中。
3）ASO無法完全阻止RNA轉(zhuǎn)錄和在DNA層面干擾表達。此外，使用ASO方法無法獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)株。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除可以完美避開上述所有弱點！基因敲除、啟動子敲除在DNA層面完全阻止RNA的表達，并且可以獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)株，一次操作，永久使用，是研究長非編碼RNA功能最有效的方法！

這兩種敲除均可以通過CRISPR/Cas9技術(shù)實現(xiàn)。而且CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)極低，大大減少了由于脫靶效應(yīng)帶來的誤判。安全又好使！

基因敲除常用的方法包含移碼突變和片段敲除，在非編碼RNA的研究中，片段敲除更有優(yōu)勢。
移碼突變造成的基因敲除，常常會出現(xiàn)以下問題：
1) 無法完整敲除所有轉(zhuǎn)錄本；
2) 許多非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄本并未被摸清，無法確認移碼突變是否能有效敲除基因；
3) 由于移碼突變所形成的的副產(chǎn)物是否會影響細胞功能仍然是個未知數(shù)。
片段敲除可以完美避開以上所有問題，為非編碼RNA的功能研究提供了極大的便利。

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