寫(xiě)在前面

????????今天推薦的是由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院在2019年8月23日發(fā)表于EBioMedicine（2020IF：8.143，JCR Q1）的一篇文章，通訊作者是Zhihai Peng教授，研究表明USP11通過(guò)PPP1CA介導(dǎo)的ERK/MAPK信號(hào)通路激活促進(jìn)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

研究背景

????????USP11是一種泛素特異性蛋白酶，通過(guò)不同的機(jī)制在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。然而，USP11在結(jié)直腸癌（CRC）中的表達(dá)和預(yù)后意義仍然未知。

摘要部分

????????USP11在結(jié)直腸癌組織中過(guò)度表達(dá)并起到致癌基因的作用。USP11的過(guò)表達(dá)或敲低分別促進(jìn)或抑制了體外和體內(nèi)CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。從機(jī)制上講，USP11通過(guò)去泛素化和保護(hù)PPP1CA免受蛋白酶體介導(dǎo)的降解來(lái)穩(wěn)定PPP1CA。此外，USP11/PPP1CA復(fù)合物通過(guò)激活ERK/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)CRC進(jìn)展。

研究?jī)?nèi)容

1.USP11在CRC中過(guò)度表達(dá)并與不良預(yù)后相關(guān)? ? ?

????????為了評(píng)估CRC和正常組織中USP11的表達(dá)水平，作者分析了Oncomine平臺(tái)上的公共數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)CRC組織中USP11的mRNA水平高于正常組織。作者還使用 qPCR分析了CRC中USP11的mRNA水平。作者發(fā)現(xiàn)CRC組織與配對(duì)的相鄰組織相比顯示出更高的USP11水平。Western blot顯示，與相鄰的正常結(jié)腸粘膜相比，結(jié)直腸癌組織中的USP11蛋白水平也顯著過(guò)表達(dá)。此外， IHC染色顯示，與鄰近結(jié)腸組織相比，結(jié)直腸癌中USP11的蛋白質(zhì)表達(dá)水平更高。這些結(jié)果表明USP11在CRC組織中mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)增加。

????????作者進(jìn)一步分析了USP11蛋白表達(dá)與CRC臨床病理特征之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)USP11高表達(dá)與腫瘤分期、腫瘤T分期和 M分期呈正相關(guān)。此外，應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析與log-rank檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估USP11預(yù)測(cè)CRC患者生存的預(yù)后價(jià)值，結(jié)果顯示，與低水平的患者相比，USP11蛋白表達(dá)水平高的患者總生存率（OS）較低。

研究結(jié)論：USP11過(guò)表達(dá)可能與CRC的腫瘤發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。

?

2.USP11在體外促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

????????為了探討USP11基因在促進(jìn)CRC發(fā)展中的潛在作用，作者測(cè)量了不同CRC細(xì)胞系中USP11的表達(dá)水平。HCT116和HCT8細(xì)胞分別在mRNA和蛋白質(zhì)水平上顯示出最高和最低的USP11表達(dá)水平。作者選擇 HCT116和HCT8細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，并用適當(dāng)?shù)膶?duì)照構(gòu)建USP11敲低和過(guò)表達(dá)細(xì)胞。Cell Counting Kit 8 (CCK8) 檢測(cè)表明，與對(duì)照組相比，USP11敲低顯著抑制HCT116細(xì)胞的細(xì)胞活力和增殖，而在USP11過(guò)表達(dá)的HCT8細(xì)胞中觀察到相反的效果。使用集落形成分析進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)。此外，傷口愈合試驗(yàn)表明，與對(duì)照相比，USP11敲低抑制了傷口閉合。相反，USP11過(guò)表達(dá)促進(jìn)了HCT8細(xì)胞中的傷口閉合。Transwell遷移和侵襲測(cè)定還顯示，與對(duì)照相比，USP11敲低或過(guò)表達(dá)分別導(dǎo)致更低或更高的細(xì)胞遷移和侵襲率。然而，流式細(xì)胞術(shù)凋亡分析顯示USP11過(guò)表達(dá)和敲低均不影響CRC細(xì)胞系的凋亡率。

研究結(jié)論：體外試驗(yàn)表明USP11增強(qiáng)了CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，但對(duì)細(xì)胞凋亡沒(méi)有影響。

?

3.USP11在體內(nèi)增強(qiáng)CRC的腫瘤發(fā)生和肝轉(zhuǎn)移

????????作者構(gòu)建一種皮下異種移植模型來(lái)評(píng)估體內(nèi)癌細(xì)胞的腫瘤發(fā)生能力以及USP11對(duì)增殖和腫瘤發(fā)生的影響。轉(zhuǎn)染 shUSP11質(zhì)粒的HCT116細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤體積小于對(duì)照。源自USP11過(guò)表達(dá)HCT8細(xì)胞的平均腫瘤體積比對(duì)照生長(zhǎng)得更快。IHC 染色顯示，與對(duì)照相比，分別在USP11敲低或過(guò)表達(dá)的異種移植腫瘤中，Ki-67 蛋白表達(dá)減弱或增強(qiáng)。由于肝臟是CRC患者中最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移器官，作者將CRC細(xì)胞注射到裸鼠的脾臟中，發(fā)現(xiàn)USP11敲低或過(guò)表達(dá)分別誘導(dǎo)肝臟中更少或更多的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)。

研究結(jié)論：USP11通過(guò)增加體內(nèi)CRC細(xì)胞增殖和肝轉(zhuǎn)移來(lái)促進(jìn)CRC的進(jìn)展。

?

4.USP11與PPP1CA有相互作用

????????為了探索USP11如何促進(jìn)CRC的進(jìn)展，作者首先用 Flag-USP11質(zhì)?；駿V質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞。然后，作者使用二維PAGE電泳和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 來(lái)鑒定由USP11過(guò)表達(dá)引起的蛋白質(zhì)表達(dá)改變，并對(duì)差異蛋白進(jìn)行KOG分析，這些結(jié)果表明USP11可能在調(diào)節(jié)蛋白磷酸酶穩(wěn)定中起作用。PPP1CA被證明通過(guò)MAPK途徑參與腫瘤發(fā)生，作者假定USP11可能通過(guò)穩(wěn)定PPP1CA來(lái)促進(jìn)CRC的進(jìn)展。為了驗(yàn)證該設(shè)想，作者研究了USP11和PPP1CA之間潛在的生化相互關(guān)系。作者發(fā)現(xiàn)USP11敲低降低了PPP1CA表達(dá)，而USP11過(guò)表達(dá)略微增加了PPP1CA表達(dá)。然后作者在HCT116細(xì)胞中進(jìn)行了內(nèi)源性Co-IP檢測(cè)，結(jié)果顯示USP11可以與HCT116細(xì)胞中的PPP1CA形成復(fù)合物。通過(guò)將Flag-USP11和 Myc-PPP1CA共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，進(jìn)一步進(jìn)行外源Co-IP檢測(cè)，結(jié)果顯示Myc-PPP1CA與 Flag-USP11發(fā)生免疫共沉淀。

研究結(jié)論：USP11和PPP1CA可以發(fā)生內(nèi)源性和外源性的相互作用。

?

5.USP11穩(wěn)定PPP1CA并保護(hù)其免受蛋白酶體降解

????????蛋白質(zhì)翻譯后修飾，并通過(guò)去泛素化穩(wěn)定下游目標(biāo)。因此，作者研究了USP11是否可以通過(guò)去泛素化來(lái)穩(wěn)定PPP1CA的表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)在HCT8或 HCT116細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)或敲低USP11分別增加或減少了PPP1CA表達(dá)。然而，PPP1CA的敲低或過(guò)表達(dá)不影響USP11蛋白水平。通過(guò) qRT-PCR，USP11的敲低和過(guò)表達(dá)均未引起PPP1CA mRNA水平的顯著變化。這些發(fā)現(xiàn)表明USP11在翻譯后調(diào)節(jié)PPP1CA。泛素化和去泛素化維持蛋白質(zhì)修飾的穩(wěn)態(tài)，異常泛素化經(jīng)常導(dǎo)致細(xì)胞生物功能的改變。然而，尚不清楚USP11是否可以通過(guò)去泛素化來(lái)穩(wěn)定PPP1CA的表達(dá)。作者將Myc-PPP1CA和 HA-泛素質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到用Flag-USP11質(zhì)?；駿V轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中。泛素化分析進(jìn)一步揭示USP11過(guò)表達(dá)顯著抑制了PPP1CA蛋白的多泛素化。相反，在HCT116細(xì)胞中通過(guò)shRNA敲低USP11增加了PPP1CA蛋白的多泛素化水平。為了證明USP11在翻譯后水平而不是蛋白質(zhì)合成水平上影響PPP1CA表達(dá)，使用蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮來(lái)研究PPP1CA的降解率。與對(duì)照相比，USP11的敲低或過(guò)表達(dá)分別導(dǎo)致添加CHX后PPP1CA的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性更低或更高。這些結(jié)果表明PPP1CA蛋白的降解率分別由于USP11敲低或過(guò)表達(dá)而增加或減少。由于USP11主要在泛素化水平上修飾蛋白質(zhì)表達(dá)，作者同時(shí)用CHX和蛋白酶體抑制劑 MG-132 (15 μM) 處理CRC細(xì)胞。作者發(fā)現(xiàn)由低USP11表達(dá)引起的PPP1CA降解被恢復(fù)。

研究結(jié)論：USP11可以通過(guò)去泛素化穩(wěn)定PPP1CA并防止泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解。

?

6.USP11以PPP1CA依賴(lài)性方式促進(jìn)MAPK信號(hào)通路

????????為了研究在CRC進(jìn)展過(guò)程中USP11是否調(diào)節(jié) MAPK 通路激活，作者進(jìn)一步檢查了參與MAPK通路的關(guān)鍵蛋白的水平。蛋白質(zhì)印跡分析表明，HCT116細(xì)胞中USP11的敲低降低了磷酸化 ERK1/2（p-ERK1/ 2)，但不影響ERK1/2水平。相反，USP11在HCT8細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)增加了p-ERK1/2蛋白水平。此外，體內(nèi)IHC染色顯示過(guò)表達(dá)或敲低USP11還可以增強(qiáng)或減少通過(guò)注射USP11過(guò)表達(dá)或敲低細(xì)胞產(chǎn)生的異種移植腫瘤中的p-ERK1/2染色。這些結(jié)果表明USP11可以特異性激活ERK依賴(lài)性MAKP信號(hào)通路。接下來(lái)，作者進(jìn)一步探究了PPP1CA在體外USP11介導(dǎo)的ERK/MAPK通路激活中的作用。作者發(fā)現(xiàn)PPP1CA過(guò)表達(dá)可以部分回補(bǔ)shUSP11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染引起的ERK1/2磷酸化降低。此外，對(duì)于位于ERK1/2上游的MEK1/2蛋白也觀察到這些類(lèi)似的結(jié)果。然而，p38、p-p38、JNK和p-JNK蛋白水平始終沒(méi)有顯著變化。

研究結(jié)論：USP11以依賴(lài)于PPP1CA的方式積極調(diào)節(jié)ERK/MAPK信號(hào)通路。

?

7.PPP1CA對(duì)USP11介導(dǎo)的CRC促進(jìn)必不可少

????????據(jù)報(bào)道，PPP1CA是蛋白磷酸酶 1 (PP1) 的三個(gè)催化亞基之一，已被證明與惡性腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。為了研究PPP1CA是否影響USP11在CRC中的致癌作用，作者使用 CCK-8和transwell測(cè)定來(lái)研究PPP1CA對(duì)USP11促進(jìn)的CRC細(xì)胞系增殖和遷移的影響。作者發(fā)現(xiàn)PPP1CA的過(guò)表達(dá)可以通過(guò)敲低HCT116細(xì)胞中的USP11來(lái)部分恢復(fù)對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。此外，這些由USP11或PPP1CA表達(dá)增加引起的對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用可能會(huì)被ERK1/2抑制劑SCH772984減弱。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PPP1CA對(duì)USP11體內(nèi)致癌作用的影響，作者將過(guò)表達(dá)PPP1CA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到USP11敲低HCT116細(xì)胞中，并將這些細(xì)胞皮下注射到裸鼠中。皮下異種移植試驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，在用 shUSP11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 HCT116細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PPP1CA產(chǎn)生的腫瘤體積更大。相反，sh-PPP1CA降低了由USP11過(guò)表達(dá)引起的異種移植腫瘤生長(zhǎng)。此外，體內(nèi)轉(zhuǎn)移測(cè)定還表明PPP1CA對(duì)于USP11介導(dǎo)的CRC轉(zhuǎn)移促進(jìn)是必不可少的。

研究結(jié)論：PPP1CA對(duì)USP11介導(dǎo)的CRC進(jìn)展至關(guān)重要。

?

結(jié)論與討論

????????使用RNA-seq分析， 作者發(fā)現(xiàn)SDC2是ARID1A缺失后的下游目標(biāo)。機(jī)制研究表明,ARID1A缺失通過(guò)染色質(zhì)重塑轉(zhuǎn)錄激活SDC2，其中SWISNF復(fù)合物中的結(jié)構(gòu)變化使SDC2的轉(zhuǎn)錄激活增強(qiáng)。作者發(fā)現(xiàn)SDC2激活致癌信號(hào)，如PI3K/Akt、Ras/MAPK和Wnt/LRP6信號(hào)通路， 以促進(jìn)SCC的發(fā)生和進(jìn)展。作者的研究結(jié)果表明,TRIM32/USP11-ARID1A-SDC2軸對(duì)SCCs的進(jìn)展至關(guān)重要這一發(fā)現(xiàn)為靶向TRIM32或SDC2治療ARID1A表達(dá)水平低的SCc病例提供了一個(gè)潛在的策略。

Thank you!

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.08.061