前面小編介紹了利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲取基因敲除細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)流程，本期內(nèi)容小編將為小伙伴們帶來(lái)敲除sgRNA設(shè)計(jì)的“保姆級(jí)”教程。每一種Cas蛋白均可在基因組上識(shí)別其特有的原間隔序列臨近基序（PAM），并在sgRNA的引導(dǎo)下在基因組PAM基序上游對(duì)基因組dsDNA進(jìn)行切割。每種Cas蛋白識(shí)別的PAM基序不同，例如運(yùn)用最廣泛的spCas9的PAM序列為NGG。部分不同物種來(lái)源的Cas9酶d對(duì)應(yīng)的PAM基序如表1。

表1.不同Cas9酶PAM序列列表

注：N為任意核苷酸；W為A/T；R為A/G；H為A/T/C；Y為T(mén)/C；V為A/C/G；

高編輯效率的gRNA通常需要滿(mǎn)足以下設(shè)計(jì)原則：

1.?sgRNA的長(zhǎng)度：SpCas9的sgRNA一般為20nt，SaCas9的sgRNA長(zhǎng)度為21nt；

2.?sgRNA序列應(yīng)盡可能覆蓋最多的靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄本：針對(duì)多轉(zhuǎn)錄本的共有序列進(jìn)行設(shè)計(jì)；

3.?sgRNA序列的堿基組成：基因特異的sgRNA 模板序列位于PAM基序之前，sgRNA的序列應(yīng)避免以4個(gè)以上的T結(jié)尾，GC含量最佳40%-60%；

4.?如果構(gòu)建U6啟動(dòng)子或T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA的表達(dá)載體，需要考慮sgRNA的5'堿基為G或GG，來(lái)提高其轉(zhuǎn)錄效率；

5.?設(shè)立在獨(dú)立外顯子上，盡量靠近蛋白N端位置（編碼區(qū)的前1/3）。若想要造成基因移碼突變，需要盡量靠近基因編碼區(qū)的ATG下游，最好位于第一或第二外顯子上，可增加基因敲除效率。

表2. sgRNA常用設(shè)計(jì)網(wǎng)站推薦

注：這些網(wǎng)站都是目前sgRNA設(shè)計(jì)的常用網(wǎng)站，采用的算法不同，各有優(yōu)缺點(diǎn)。針對(duì)同一個(gè)基因的敲除，小伙伴們可以多使用幾個(gè)網(wǎng)站進(jìn)行sgRNA設(shè)計(jì)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)設(shè)計(jì)原則擇優(yōu)選取。

下面小編以敲除人源 NLE1?基因?yàn)槔?，利?strong>CRISPOR網(wǎng)站進(jìn)行特異性sgRNA設(shè)計(jì)：

1、打開(kāi)NCBI，選擇Gene，搜索基因名稱(chēng)及物種名稱(chēng)：

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2、下拉至“Gennomic?regions，transcripts，and?products”模塊，查看轉(zhuǎn)錄本情況。如圖，該基因共有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，深綠色方塊代表外顯子，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的共有CDS區(qū)為右邊紅方框圈起來(lái)的區(qū)域，為第二個(gè)轉(zhuǎn)錄本的完整編碼區(qū)。

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3、復(fù)制第二個(gè)轉(zhuǎn)錄本的NM號(hào)，用SnapGene打開(kāi)，可顯示編碼區(qū)所在外顯子的情況。中間有間隔的為不同的外顯子。

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4、點(diǎn)擊共有CDS所在的第二個(gè)完整外顯子，復(fù)制序列。打開(kāi)CRISPOR網(wǎng)站→將序列復(fù)制至序列粘貼區(qū)→選擇物種/基因組→選擇適配Cas酶，點(diǎn)擊“submit”，即可生成結(jié)果網(wǎng)頁(yè)。

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5、此處可顯示特異性，綠色、黃色及紅色分別表示在基因組上高、中、低的特異性。

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此處顯示sgRNA具體的序列及相關(guān)參數(shù)，主要參考MIT/CFD特異性參數(shù)：越大脫靶概率越低，建議選擇這兩項(xiàng)均在70以上的sgRNA。另外預(yù)測(cè)有效性值越大越好。最后結(jié)合sgRNA設(shè)計(jì)原則進(jìn)行綜合選擇。

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6、選定sgRNA后，復(fù)制序列→打開(kāi)NCBI的Blast模塊→選擇基因組Blast→選擇物種→跳轉(zhuǎn)至blast頁(yè)面→粘貼序列→點(diǎn)擊搜索→點(diǎn)擊右上角切換到傳統(tǒng)視圖。

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7、下拉至詳細(xì)描述頁(yè)，可看到完全匹配的為靶標(biāo)基因所在的NC號(hào)，其余均出現(xiàn)不同程度的堿基錯(cuò)配現(xiàn)象，說(shuō)明所選sgRNA在基因組上具備良好的特異性，可用于后續(xù)敲除實(shí)驗(yàn)。

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以本示例中的人源 NLE1?基因?yàn)槔?，該基因的最長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本在共有CDS之前仍包含7個(gè)外顯子，僅在共有區(qū)設(shè)計(jì)一個(gè)sgRNA極大可能無(wú)法完全敲除該基因所有轉(zhuǎn)錄本所轉(zhuǎn)錄翻譯的蛋白。針對(duì)這種情況，建議小伙伴們針對(duì)不同區(qū)域多設(shè)計(jì)幾個(gè)sgRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，檢測(cè)實(shí)際敲除效率。

常用的基因敲除除了單sgRNA系統(tǒng)外，還有雙sgRNA作用系統(tǒng)，設(shè)計(jì)原則及選擇標(biāo)準(zhǔn)與上文所述一致，兩種方法各具優(yōu)缺點(diǎn)，具體表現(xiàn)如下：

單sgRNA敲除系統(tǒng)：在編碼外顯子上設(shè)計(jì)1個(gè)sgRNA，依賴(lài)細(xì)胞本身的非同源末端連接(NHEJ)機(jī)制引入或缺失堿基，造成移碼突變，從最終得到的混合克隆中篩選符合實(shí)驗(yàn)要求的敲除陽(yáng)性克隆。缺點(diǎn)：1、篩選鑒定復(fù)雜，無(wú)法從PCR結(jié)果直接判斷敲除結(jié)果。PCR產(chǎn)物測(cè)序峰圖解讀困難，存在多重套峰的現(xiàn)象，需要做亞克隆分析才能獲得準(zhǔn)確的敲除結(jié)果。2、敲除效果存在不確定性，在外顯子上設(shè)計(jì)sgRNA，尤其外顯子較小時(shí)，容易產(chǎn)生新的mRNA剪切突變體，產(chǎn)生新的突變蛋白或者跟野生型蛋白類(lèi)似的突變蛋白，導(dǎo)致后續(xù)蛋白檢測(cè)分析結(jié)果不確定。

雙sgRNA敲除系統(tǒng)：選擇編碼基數(shù)為非3倍數(shù)的外顯子作為敲除區(qū)域，分別在外顯子上游和下游的內(nèi)含子上設(shè)計(jì)sgRNA，令兩條sgRNA間的外顯子序列和部分內(nèi)含子序列同時(shí)被刪除。其刪除的編碼堿基數(shù)確定，刪除片段較大，只需通過(guò)PCR檢測(cè)即可判斷敲除結(jié)果，同時(shí)發(fā)生新的mRNA剪接突變體的概率大大降低，因而敲除效果更有保障，拿到細(xì)胞后鑒定分析也更簡(jiǎn)單。

總的來(lái)說(shuō)，單sgRNA敲除系統(tǒng)效率高，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，但后續(xù)蛋白檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)較大，往往會(huì)出現(xiàn)WB敲除不干凈的現(xiàn)象，導(dǎo)致敲除變成干擾；雙sgRNA敲除需要兩個(gè)sgRNA同時(shí)起作用，效率較低，但后續(xù)蛋白檢測(cè)背景干凈，結(jié)果有保證。

以上便是本期敲除sgRNA設(shè)計(jì)干貨的全部?jī)?nèi)容，你學(xué)會(huì)了嗎？若還是沒(méi)學(xué)會(huì)，那么專(zhuān)業(yè)的事請(qǐng)專(zhuān)業(yè)的人來(lái)做：漢恒可提供sgRNA設(shè)計(jì)及相關(guān)病毒包裝以及敲除細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)，如有技術(shù)問(wèn)題或產(chǎn)品訂購(gòu)需求，歡迎隨時(shí)咨詢(xún)！

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參考文獻(xiàn)：

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