PCR儀使用注意事項(xiàng)-參數(shù)設(shè)定

PCR儀使用參數(shù)設(shè)定不正確會(huì)影響到PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這主要表現(xiàn)在溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)上，如果溫度參數(shù)設(shè)置過(guò)高，延伸時(shí)間不夠都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，下面談?wù)勈褂肞CR儀參數(shù)設(shè)定時(shí)的注意事項(xiàng)：
一、溫度和時(shí)間
溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA?聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因(長(zhǎng)度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。
①變性溫度與時(shí)間
變性溫度低，解鏈不完整是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃?1min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。
②退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間
退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間相結(jié)合。
③延伸溫度與時(shí)間
Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃時(shí)， DNA合成幾乎不能進(jìn)行。
PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1Kb以?xún)?nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。
二、循環(huán)次數(shù)
循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量也隨之增多。

如何確定pcr退火溫度？以及程序設(shè)計(jì)？

具體沒(méi)有定數(shù)，“退火溫度要低于理論Tm值”只能說(shuō)是常規(guī)操作、約定俗成，就算直接Tm值整數(shù)值跑也沒(méi)問(wèn)題，關(guān)鍵在于掌握Tm和退火溫度、引物特異性之間關(guān)系：退火溫度要低于理論Tm值，以使引物能夠與可能的模板互補(bǔ)配對(duì)；同時(shí)，PCR儀退火溫度設(shè)置還要可能足夠高，以避免引物與模板間的非特異性擴(kuò)增。綜上，最佳的方法是采用“梯度（降落）PCR”，首先以引物Tm整數(shù)值為退火溫度跑5~10個(gè)循環(huán)，然后以低于引物理論Tm值的溫度【最低不低于引物理論Tm10℃，可采用Tm-5的溫度跑】跑20~30個(gè)循環(huán)，以獲得最佳PCR效果【既特異性強(qiáng)，又效率高、產(chǎn)物多】至于上下游引物Tm值應(yīng)選取兩者中的最低溫度作為兩條引物的Tm，并進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)程序設(shè)置。一般引物Tm要在60，pcr退火參數(shù)溫度在55，但也不必刻意強(qiáng)求。

PCR實(shí)驗(yàn)最常見(jiàn)的9個(gè)問(wèn)題及解決方案

1. 如何有效設(shè)計(jì)引物

（1）使用Oligo或Primer設(shè)計(jì)引物，在保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)，長(zhǎng)度一般在18-27bp，上下游引物Tm值最好是60-75℃，GC含量=40%-60%，引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，避免發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

2. PCR電泳無(wú)擴(kuò)增條帶

（1）酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或運(yùn)輸不當(dāng)而失活，往往通過(guò)更換新酶或用另一來(lái)源的酶以獲得滿意的結(jié)果。

（2）模板含有雜質(zhì)。特別是對(duì)甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。

（3）變性溫度是否準(zhǔn)確：PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度是否相符，過(guò)高酶在前幾個(gè)循環(huán)就迅速失活；過(guò)低則模板變性不徹底。

（4）反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前，將反應(yīng)體系95℃加熱5-10分鐘。

（5）引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲(chǔ)存條件不當(dāng)而失活。

（6）引物錯(cuò)誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。

（7）DNA凝膠電泳時(shí)加入陽(yáng)性對(duì)照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問(wèn)題。

3. PCR產(chǎn)物量過(guò)少

（1）退火溫度不合適。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。

（2）DNA模板量太少。增加DNA模板量。

（3）PCR循環(huán)數(shù)不足。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)。

（4）引物量不足。增加體系中引物含量。

（5）延伸時(shí)間太短。以1kb/分鐘的原則設(shè)置延伸時(shí)間。

（6）變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致DNA聚合酶失活。

（7）DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈

4. 擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散

（1）酶量過(guò)高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來(lái)源的酶。

（2）dNTP濃度過(guò)高。減少dNTP的濃度。

（3）MgCl2濃度過(guò)高。可適當(dāng)降低其用量。

（4）模板量過(guò)多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。

（5）引物濃度不夠優(yōu)化。對(duì)引物進(jìn)行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。

（6）循環(huán)次數(shù)過(guò)多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時(shí)間及延伸時(shí)間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。

（7）退火溫度過(guò)低。

（8）電泳體系有問(wèn)題：

①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；

②凝膠沒(méi)有凝固好；

③瓊脂糖質(zhì)量差。

（9）若為PCR試劑盒則可能：

①由于運(yùn)輸儲(chǔ)存不當(dāng)引起試劑盒失效；

②試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。

（10）降解的陳舊模板擴(kuò)增也易產(chǎn)生涂布。

5. 擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶（雜帶）

（1）引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。

（2）循環(huán)的次數(shù)過(guò)多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。

（3）酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。

（4）退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。

（5）樣品處理不當(dāng)。

（6）Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。

（7）若為PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題。

（8）復(fù)制提前終止。使用非熱啟動(dòng)的聚合酶時(shí)常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動(dòng)聚合酶。

（9）反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。

（10）引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。

（11）引物量過(guò)多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。

（12）模板量過(guò)多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。

（13）外源DNA污染。確保操作的潔凈。

6. 陰性對(duì)照出現(xiàn)條帶

（1）試劑，槍頭，工作臺(tái)污染。使用全新的試劑和槍頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。

7. 條帶大小與理論不符

（1）污染。使用全新的試劑和槍頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。

（2）模板或引物使用錯(cuò)誤。查看引物是否會(huì)擴(kuò)增部分條帶和模板是否正確。

3)基因亞型。對(duì)研究的基因進(jìn)行序列分析和BLAST研究。

8. 持續(xù)出現(xiàn)假性條帶

（1）起始退火溫度太低，或目的擴(kuò)增產(chǎn)物和非目的產(chǎn)物的T值相差不大?？蓢L試適當(dāng)提高PCR溫度或者設(shè)置降落PCR，降低循環(huán)數(shù)。

9. 菌落PCR檢測(cè)有條帶，接種大搖后無(wú)條帶

（1）可重新以菌落和菌液為模板進(jìn)行PCR對(duì)照檢測(cè)，因?yàn)榫銹CR的假陽(yáng)性概率還是比較高。如果仍出現(xiàn)上述結(jié)果，推測(cè)可能是平板上連接液中的未連接載體的擴(kuò)增引起的目的條帶，進(jìn)一步質(zhì)粒PCR檢測(cè)，可證明目的片段是否真正連接成功。

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