1、實(shí)驗(yàn)介紹

同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術(shù)由AB SCIEX公司研發(fā)的一種體外同種同位素標(biāo)記的相對(duì)與絕對(duì)定量技術(shù)。該技術(shù)利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)，經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時(shí)比較多達(dá)8種樣品之間的蛋白表達(dá)量，是近年來定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)。

2、實(shí)驗(yàn)步驟:

2.1樣品準(zhǔn)備:將待測(cè)樣品進(jìn)行定量計(jì)算出樣品蛋白濃度;

2.2蛋白還原烷基化及酶解:每組樣品各取100μg按照iTRAQ試劑盒要求進(jìn)行處理，使用測(cè)序級(jí)胰蛋白酶溶液酶解后,超濾管離心收集酶解肽段;

2.3 iTRAQ標(biāo)記:將ITRAQ試劑平衡到室溫,用150μL異丙醇溶解，取酶解肽段加入iTRAQ試劑后室溫反應(yīng)2 h,加入水終止反應(yīng)，等量混合不同組樣品，真空冷凍干燥樣品: .

2.4 LC-MS-MS分析:使用Thermo的Q-Exactive Orbitrap進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。

2.5數(shù)據(jù)處理及生信分析

3、iTRAQ、TMT技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

3.1同時(shí)對(duì)2-8種不同條件樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)差異分析；

3.2不會(huì)破壞所測(cè)定的蛋白質(zhì)；

3.3適合樣品類型多：胞漿蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等；

3.4與凝膠分離的蛋白質(zhì)定量技術(shù)相比，iTRAQ質(zhì)譜定量技術(shù)可檢測(cè)到更多類型的蛋白質(zhì)分子，如低豐度蛋白質(zhì)、強(qiáng)酸（堿）性蛋白質(zhì)、<10KD或>100KD的蛋白質(zhì)分子；高通量，可一次實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品的蛋白質(zhì)定性定量；

3.5標(biāo)記完全，標(biāo)記效率高達(dá)97%以上；

3.6幾乎兼容所有來源的樣本；

3.7定量敏感，反應(yīng)速度快，實(shí)驗(yàn)周期短。

4、常見樣品類型

5、示例圖

ITRAQ標(biāo)記譜圖

蛋白互作圖