肌肉萎縮是一種以骨骼肌質(zhì)量和力量衰減為主要特征的機(jī)能衰退，是許多急性和慢性疾?。ㄌ悄虿?、慢性阻塞性肺疾病和腎功能衰竭等）的常見臨床特征。肌肉萎縮表現(xiàn)為肌肉質(zhì)量和功能下降，導(dǎo)致生活質(zhì)量下降，并發(fā)癥風(fēng)險增加，甚至死亡。然而，目前對肌肉萎縮的治療方法仍未攻克。

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類非編碼RNA，由前體mRNA反向剪接和選擇性剪接形成的共價閉合的環(huán)型分子。circRNA具有miRNA和蛋白質(zhì)海綿作用，進(jìn)而間接調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。此外，部分circRNA可以翻譯成蛋白質(zhì)或多肽來行使調(diào)控功能。越來越多研究表明，circRNA可以作為某些疾病的潛在生物標(biāo)志物和治療藥物靶點。然而，circRNA在肌肉萎縮中的作用仍有待研究。

2023年4月23日，上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院心血管研究所李進(jìn)副教授和肖俊杰教授團(tuán)隊在Advanced Science發(fā)表文章CircTmeff1 Promotes Muscle Atrophy by Interacting with TDP-43 and Encoding A Novel TMEFF1-339aa Protein。作者揭示了一個多種不同類型所致肌肉萎縮發(fā)生的共同新靶點——環(huán)狀RNAcircTmeff1。研究發(fā)現(xiàn)circTmeff1在多種類型肌肉萎縮模型中高度表達(dá)；過表達(dá)circTmeff1可以誘發(fā)肌肉萎縮的發(fā)生，而敲低circTmeff1則可以緩解肌肉萎縮。此外，circTmeff1和TDP43互作會進(jìn)一步激活cGAS/STING信號通路，進(jìn)而促進(jìn)肌肉萎縮；而且，circTmeff1可以通過滾環(huán)翻譯產(chǎn)生一個全新的蛋白質(zhì)TMEFF1-339aa，促進(jìn)肌肉萎縮的發(fā)生。文章解析了環(huán)狀RNA在肌肉萎縮中的相關(guān)機(jī)制，為肌肉萎縮的治療提供了全新的治療靶點。

CircTmeff1在肌肉萎縮中上調(diào)

首先，作者通過對肌肉萎縮模型小鼠和假手術(shù)小鼠進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)364個circRNA表達(dá)上調(diào)，551個circRNA表達(dá)下調(diào)。聚焦到一個表達(dá)上調(diào)且與人類環(huán)狀RNA的同源性最高的circRNA，它的母基因是長度為339個核苷酸的Tmeff1基因。FISH驗證其主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。綜上表明，circTmeff1是一種新發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA，在多種類型的肌肉萎縮中表達(dá)上調(diào)。

CircTmeff1在體外和體內(nèi)均促進(jìn)肌肉萎縮

免疫熒光結(jié)果顯示，過表達(dá)circTmeff1降低了C2C12肌管的直徑和面積。qRT-PCR分析顯示，過表達(dá)circTmeff1使泛素蛋白連接酶E3s（Atrogin-1和MuRF-1）表達(dá)上調(diào)。通過Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)circTmeff1過表達(dá)會使UPS增強(qiáng)、ALP被激活、凋亡增強(qiáng)、PI3K/AKT合成代謝信號傳導(dǎo)減少。接著，作者運(yùn)用了AAV8載體介導(dǎo)circTmeff1過表達(dá)，再將病毒顆粒注射進(jìn)小鼠的多處肌肉并在6周后評估其肌肉萎縮情況，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的circTmeff1會導(dǎo)致肌肉重量和肌肉功能受損。同時，當(dāng)circTmeff1在GA肌肉中過表達(dá)時，蛋白質(zhì)分解途徑（UPS、ALP和細(xì)胞凋亡）被激活，AKT/FOXO3A/mTOR信號通路受到抑制。總的來說，circTmeff1在肌肉中的過表達(dá)足以誘導(dǎo)肌肉萎縮。

抑制CircTmeff1的表達(dá)可以緩解肌肉萎縮

免疫熒光和qRT-PCR結(jié)果顯示，利用siRNA將circTmeff1敲低后，抑制了C2C12肌管直徑的減小，Atrogin-1和MuRF-1的表達(dá)量增加。分別在Imo和AngII誘導(dǎo)的肌肉萎縮模型中，進(jìn)一步利用AAV8介導(dǎo)的circTmeff1 shRNA進(jìn)行干擾，發(fā)現(xiàn)敲低circTmeff1后均增強(qiáng)了肌肉質(zhì)量，減少了Atrogin-1和MuRF-1的表達(dá)，增加了肌纖維的CSA，并重新激活了AKT/FOXO3A/mTOR信號通路，緩解了肌肉萎縮。為了模擬臨床試驗，作者在SWI肌肉萎縮模型中進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)AAV8-sh-circTmeff1療法circTmeff1敲低可以恢復(fù)SWI小鼠的握力、運(yùn)動耐力和強(qiáng)直收縮功能。總之，抑制circTmeff1顯著減輕了肌肉萎縮。

CircTmeff1與TDP-43蛋白相互作用

為了探索circTmeff1促進(jìn)肌肉萎縮的分子機(jī)制，作者首先使用RBPsuite分析了與之結(jié)合的蛋白，并通過RNA pull-down實驗發(fā)現(xiàn)circTmeff1可以特異性結(jié)合TDP-43，而且運(yùn)用RIP技術(shù)證實了TDP-43和circTmeff1之間存在相互作用。接著，作者通過共聚焦免疫熒光分析TDP-43和線粒體在C2C12細(xì)胞中的共定位情況，發(fā)現(xiàn)circTmeff1可以促進(jìn)TDP-43聚集在線粒體中，而且細(xì)胞溶膠-線粒體分離實驗結(jié)果也證實了這一點。此外，在注射AAV8-circTmeff1-OE的小鼠腓腸肌細(xì)胞中也觀察到相同的結(jié)果。通過qRT-PCR檢測mtCOI，發(fā)現(xiàn)circTmeff1促進(jìn)了mtDNA在胞質(zhì)溶膠中積累。接著，作者用Western-blot實驗證實過表達(dá)circTmeff1會激活cGAS/STING通路。綜上表明，circTmeff1在線粒體中募集TDP-43從而形成聚集體，觸發(fā)線粒體DNA釋放到胞質(zhì)溶膠中，并最終激活肌肉細(xì)胞中的cGAS/STING途徑。

CircTmeff1編碼一種新蛋白質(zhì)——TMEFF1-339aa蛋白及其促進(jìn)肌肉萎縮的作用

作者通過生信預(yù)測分析和蔗糖梯度分級實驗，發(fā)現(xiàn)circTmeff1在C2C12細(xì)胞的所有多聚體部分均被檢測到，表明circTmeff1具有翻譯功能。接著，作者預(yù)測了一個IRES序列并運(yùn)用雙熒光素酶報告載體進(jìn)行驗證，表明circTmeff1-IRES進(jìn)行非5’端帽依賴性翻譯。

為了驗證circTmeff1的ORF是否可以在體內(nèi)滾環(huán)翻譯成339aa蛋白，作者構(gòu)建了3×Flag-circTmeffl載體使其過表達(dá)，通過Western-blot檢測到新蛋白在38kDa附近，進(jìn)一步運(yùn)用LC-MS檢測并鑒定出新蛋白為TMEFF1-339aa。接著，作者構(gòu)建了一個具有3×Flag的TMEFF1-399Aa線性全長序列的過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞中并進(jìn)行免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)TMEFF1-339aa位于細(xì)胞質(zhì)中。此外，TMEFF1-339aa在C2C12肌管細(xì)胞中過表達(dá)可減小肌管直徑，促進(jìn)Atrogin-1和MuRF-1的表達(dá)，激活UPS和ALP，并抑制AKT/FOXO3A/mTOR信號通路。綜上表明，過表達(dá)TMEFF1-339aa能在體外促進(jìn)肌肉萎縮。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1002/advs.202206732