PROTAC（proteolysis-targeting chimeras）是一種異雙功能分子，分子的一端連接結(jié)合靶蛋白的配體，一端連接E3連接酶的配體，中間通過(guò)合適的Linker相連。PROTAC降解靶蛋白是通過(guò)泛素蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）實(shí)現(xiàn)的，其大致過(guò)程如下，PROTAC分子結(jié)合靶蛋白（POI）和E3連接酶，形成三元復(fù)合物，給靶蛋白打上泛素化的標(biāo)簽，泛素化的蛋白被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體26S識(shí)別并降解。

PROTAC技術(shù)是一種利用泛素－蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）對(duì)靶蛋白進(jìn)行降解的藥物開(kāi)發(fā)技術(shù)。該技術(shù)可用來(lái)清除腫瘤細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白，使其不能發(fā)揮致癌作用，以達(dá)到腫瘤治療的目的。腫瘤治療后期的持續(xù)用藥會(huì)由于腫瘤基因突變導(dǎo)致耐藥性的發(fā)生，理論上PROTAC可以避免這樣情況的發(fā)生。接下來(lái)這篇綜述強(qiáng)調(diào)了“蛋白質(zhì)組學(xué)”在更好地表征蛋白質(zhì)降解的選擇性、蛋白豐度和動(dòng)態(tài)活性方面的重要作用。

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析在藥物發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，判斷PROTAC分子理論降解靶點(diǎn)和實(shí)際靶點(diǎn)是否一致，是否產(chǎn)生脫靶蛋白，是衡量該分子能否成藥的關(guān)鍵。對(duì)于靶蛋白的選擇是PROTAC需要了解的最重要參數(shù)之一，因脫離結(jié)合和降解的靶點(diǎn)（即脫靶）可以為未知的安全指標(biāo)提供信息。蛋白質(zhì)組學(xué)可以通過(guò)評(píng)估E3連接酶和目標(biāo)蛋白的濃度并測(cè)量目標(biāo)參與的實(shí)際數(shù)量來(lái)進(jìn)一步區(qū)分表型中哪些方面是由結(jié)合驅(qū)動(dòng)的，哪些是由降解驅(qū)動(dòng)的。通過(guò)組學(xué)分析可以區(qū)分由降解和結(jié)合效應(yīng)的不同而受到影響的途徑，例如CDK9抑制劑與降解劑處理之間的基因轉(zhuǎn)錄差異。在這些情況下，通路方面的影響可以通過(guò)組學(xué)數(shù)據(jù)得到，并且轉(zhuǎn)錄與蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)可以相輔相成。

細(xì)胞中目標(biāo)蛋白質(zhì)被降解的速度和可實(shí)現(xiàn)的最大降解水平受其數(shù)量與其自然補(bǔ)充的速度影響。一個(gè)自然快速補(bǔ)充的高豐度蛋白比一個(gè)沒(méi)有補(bǔ)充的蛋白更難在一定時(shí)間內(nèi)降解到顯著水平。除了目標(biāo)蛋白濃度外，E3連接酶的濃度是另一個(gè)重要的參數(shù)，基本上可以決定基于PROTAC的方法成功或失敗。E3連接酶豐度影響的一個(gè)典型的例子是BCL-XL：Von Hippel-Lindau腫瘤抑制因子（VHL）的缺失阻止了基于VHL的BCL-XL PROTAC對(duì)血小板中BCL-XL的降解，從而限制了毒性并防止血小板減少癥的發(fā)生?；谫|(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析是了解和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)降解的的重要發(fā)現(xiàn)工具。為了確定這些蛋白質(zhì)在感興趣的組織中的豐度，可以使用依賴(lài)數(shù)據(jù)（DDA）和不依賴(lài)數(shù)據(jù)（DIA）的采集方法。相對(duì)表達(dá)量可以通過(guò)使用標(biāo)記定量與非標(biāo)定量組學(xué)技術(shù)以比較不同的細(xì)胞系和組織，并可與mRNA表達(dá)相結(jié)合確定在模型中差異表達(dá)的新E3連接酶。此外，DDA和DIA方法還可用于確定所關(guān)注的特定蛋白質(zhì)的數(shù)量，這對(duì)于比較不同物種之間的E3水平尤其重要。

給定PROTAC療效的另一個(gè)關(guān)鍵變量是被降解的蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)率（PTR）。由于蛋白質(zhì)的重新合成將是目標(biāo)降解后功能恢復(fù)的一個(gè)因素，因此在開(kāi)發(fā)早期測(cè)量蛋白質(zhì)的半衰期可以幫助項(xiàng)目進(jìn)展。在選擇目標(biāo)時(shí)盡早測(cè)量蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)率是至關(guān)重要的，因?yàn)橹苻D(zhuǎn)率可以用來(lái)制定目標(biāo)化合物的概況，并確定降解劑是否是最佳的藥物模式。蛋白質(zhì)的再合成可以在PROTAC處理和洗脫后使用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)水平定量方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行測(cè)量，然而，實(shí)驗(yàn)測(cè)得的再合成率可以根據(jù)各種化合物的特性而變化，如最大降解水平、脫落率、蛋白質(zhì)結(jié)合與親脂性；另一種測(cè)量PTR常用方法是用抑制劑（如環(huán)己酮）來(lái)抑制蛋白質(zhì)的合成，鑒于這些抑制劑廣泛的生物學(xué)影響，以及細(xì)胞對(duì)其有限的容忍時(shí)間，使用蛋白質(zhì)合成抑制劑測(cè)量的PTR缺乏準(zhǔn)確性。

測(cè)量蛋白質(zhì)PTR的金標(biāo)準(zhǔn)是SILAC（細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)）質(zhì)譜法。采用含有輕、 重同位素型必需氨基酸的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞傳若干代后，細(xì)胞內(nèi)蛋白被同位素穩(wěn)定標(biāo)記，將蛋白質(zhì)等量混合后進(jìn)行分離和質(zhì)譜鑒定，根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜圖中兩個(gè)同位素型肽段的面積比較進(jìn)行相對(duì)定量。這些測(cè)量可以通過(guò)跟蹤標(biāo)記的和未標(biāo)記的蛋白質(zhì)來(lái)測(cè)量降解率和合成率。可以使用富集或非富集方法測(cè)量單個(gè)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)情況。或者，可以同時(shí)測(cè)量數(shù)千種蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)率。Zecha等人將SILAC與TMT標(biāo)記定量組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，從單個(gè)細(xì)胞系中產(chǎn)生了6000多個(gè)PTR,研究表明，蛋白質(zhì)的不同蛋白質(zhì)形式可以具有不同的周轉(zhuǎn)率，這在設(shè)計(jì)和解釋靶向PTR實(shí)驗(yàn)時(shí)具有重要意義。SILAC定量技術(shù)的進(jìn)步也使非分裂細(xì)胞的周轉(zhuǎn)率測(cè)量更加準(zhǔn)確。

表征蛋白質(zhì)降解劑的一個(gè)關(guān)鍵方面是能夠區(qū)分降解的直接靶標(biāo)和隨時(shí)間推移的途徑效應(yīng)。多重蛋白質(zhì)組動(dòng)力學(xué)分析（mPDP）方法巧妙地將動(dòng)態(tài)SILAC與蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合，以研究蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)劑的機(jī)制。在該方法中，細(xì)胞在標(biāo)記的SILAC培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并且在復(fù)合處理時(shí)，將培養(yǎng)基一式兩份切換到相反的SILAC標(biāo)記。多重質(zhì)譜分析可以將成熟（預(yù)先存在的）蛋白質(zhì)的變化與新生蛋白質(zhì)（在化合物處理和標(biāo)記交換后合成的蛋白質(zhì)）區(qū)分開(kāi)來(lái)。例如，該方法通過(guò)檢測(cè)成熟和新生蛋白中BR2、BRD3和BRD4的豐度降低，成功的將類(lèi)似于JQ1的BET抑制劑與JQ1-PROTAC區(qū)分開(kāi)來(lái)，有趣的是，該方法還將FYTTD1（一種TREX復(fù)合物銜接物）鑒定為JQ1的脫靶，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的下游停滯。由于SILAC標(biāo)記的前處理要求，mPDP比標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)更耗時(shí)，最適合用于復(fù)雜的機(jī)理問(wèn)題研究。

最后作者對(duì)如何將蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于PROTAC進(jìn)行了總結(jié)（圖1），包括用于測(cè)量選擇性，蛋白質(zhì)豐度和蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的測(cè)定。

總結(jié)

蛋白質(zhì)組學(xué)能夠在蛋白組水平上，深度分析不同樣本之間蛋白的豐度差異，為PROTAC蛋白降解劑開(kāi)發(fā)與優(yōu)化提供必需的數(shù)據(jù)支持。

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析是一種發(fā)現(xiàn)工具，使研究人員能夠了解候選藥物的作用機(jī)制。當(dāng)應(yīng)用PROTAC時(shí)，運(yùn)用選擇性降解蛋白以及與療效和安全性相關(guān)機(jī)制的非依賴(lài)質(zhì)譜采集技術(shù)相結(jié)合。蛋白組學(xué)的全局分析實(shí)驗(yàn)可以識(shí)別直接降解，并評(píng)估可能由降解或脫靶抑制引起的下游途徑機(jī)制。靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法可用于量化相關(guān)E3連接酶的水平以及目標(biāo)細(xì)胞系和組織中的目標(biāo)蛋白，并在項(xiàng)目早期提供有關(guān)的數(shù)據(jù)信息。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)方法可用于了解蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和再合成率，并告知靶標(biāo)可追蹤性以及藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)理解。

會(huì)議信息

BPCF2023第四屆中國(guó)（北京）生物藥工藝高峰論壇四月與您相約北京！

主辦單位：生物藥資訊

會(huì)議主題：BPCF2023第四屆中國(guó)（北京）生物藥工藝高峰論壇

會(huì)議時(shí)間：2023年04月03-04號(hào)

會(huì)議地點(diǎn)：北京朗麗茲西山花園酒店