散文網(wǎng) » 科技 »自然 » 最早的基因編輯工具——?dú)w巢核酸內(nèi)切酶(Meganuclease)

最早的基因編輯工具——?dú)w巢核酸內(nèi)切酶(Meganuclease)

2020-05-22 22:01 作者:制御秘書(shū)長(zhǎng)杜鵑 0人讀過(guò) | 我要投稿

? ? ? ?今天介紹的是最早的基因編輯工具——?dú)w巢核酸內(nèi)切酶(Meganuclease)

簡(jiǎn)介

? ? ? ? 歸巢核酸內(nèi)切酶(Meganuclease)是具有較大識(shí)別位點(diǎn)(12至40個(gè)堿基對(duì)的雙鏈DNA序列)特征的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶，該酶的切割位點(diǎn)在任何給定的基因組中通常只出現(xiàn)一次。例如，被I-SceI歸巢核酸內(nèi)切酶識(shí)別的18個(gè)堿基對(duì)的序列平均需要一個(gè)人類基因組大小的二十倍的基因組才能被一次偶然發(fā)現(xiàn)(盡管具有單個(gè)錯(cuò)配的序列對(duì)于每個(gè)人來(lái)說(shuō)大約發(fā)生三次每一個(gè)人類的基因組)。因此，歸巢核酸內(nèi)切酶被認(rèn)為是最特異性的天然限制酶。

? ? ? ?在歸巢核酸內(nèi)切酶中，歸巢核酸內(nèi)切酶的LAGLIDADG家族已成為過(guò)去15年研究基因組和基因組工程的重要工具。歸巢核酸內(nèi)切酶是“分子DNA剪刀”，可用于以高度靶向的方式替換，消除或修飾序列。通過(guò)蛋白質(zhì)工程修飾它們的識(shí)別序列，可以改變目標(biāo)序列。歸巢核酸內(nèi)切酶用于修飾所有基因組類型，無(wú)論是細(xì)菌，植物還是動(dòng)物。它們?yōu)閯?chuàng)新開(kāi)辟了廣闊的渠道，特別是在人類健康領(lǐng)域，例如，消除HIV病毒遺傳物質(zhì)或使用基因療法“修復(fù)”受損的基因。

兩大“幫派”

? ? ? ? 歸巢核酸內(nèi)切酶存在于許多生物中：古細(xì)菌、細(xì)菌、噬菌體、真菌、酵母、藻類和一些植物。它們可以在細(xì)胞的不同區(qū)域中表達(dá)–細(xì)胞核、線粒體或葉綠體。已經(jīng)鑒定出數(shù)百種這些酶。

? ? ? ?歸巢核酸內(nèi)切酶主要由兩個(gè)主要的酶家族(統(tǒng)稱為歸巢核酸內(nèi)切酶)代表：內(nèi)含子內(nèi)切核酸酶和內(nèi)含肽內(nèi)切核酸酶。

? ? ? ? 在自然界中，這些蛋白質(zhì)由移動(dòng)遺傳元件，內(nèi)含子或內(nèi)含肽編碼。內(nèi)含子通過(guò)在DNA的精確位置進(jìn)行干預(yù)而傳播，其中大范圍核酸酶的表達(dá)在互補(bǔ)的無(wú)內(nèi)含子或無(wú)內(nèi)含肽的等位基因中產(chǎn)生斷裂。對(duì)于內(nèi)含子和第I組內(nèi)含子，這種斷裂通過(guò)雙鏈DNA斷裂的同源重組修復(fù)導(dǎo)致內(nèi)含子或內(nèi)含子在切割位點(diǎn)重復(fù)。

? ? ? ? 我們對(duì)歸巢核酸內(nèi)切酶的實(shí)際用途知之甚少。人們普遍認(rèn)為，編碼歸巢核酸內(nèi)切酶的遺傳物質(zhì)起著寄生元件的作用，利用其自身的優(yōu)勢(shì)，利用雙鏈DNA細(xì)胞修復(fù)機(jī)制作為繁殖和擴(kuò)散的手段，而不會(huì)破壞其宿主的遺傳物質(zhì)。

來(lái)自LAGLIDADG家族的歸巢核酸內(nèi)切酶

? ? ? ? 歸巢核酸內(nèi)切酶有五個(gè)家族或五類。最廣泛和最廣為人知的是LAGLIDADG系列。LAGLIDADG家族核酸內(nèi)切酶主要存在于真核單細(xì)胞生物的線粒體和葉綠體中。

? ? ? ? 該家族的名稱對(duì)應(yīng)于在該家族的所有蛋白質(zhì)中或多或少保守的氨基酸序列，這些小蛋白質(zhì)還以其緊湊和緊密堆積的三維結(jié)構(gòu)而聞名。

? ? ? ? 在研究和基因組工程中最廣泛使用的特征最豐富的核酸內(nèi)切酶包括I-SceI(發(fā)現(xiàn)于啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae的線粒體中)，I-CreI(來(lái)自衣藻Chlamydomonas reinhardtii的葉綠體)和I-DmoI(來(lái)自古菌Desulfurococcus mobilis)。

? ? ? ? 最著名的LAGLIDADG核酸內(nèi)切酶是同型二聚體（例如I-CreI，由兩個(gè)相同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的副本組成）或內(nèi)部對(duì)稱單體(I-SceI)。包含催化結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合位點(diǎn)由切割點(diǎn)兩側(cè)的兩個(gè)部分組成。半結(jié)合位點(diǎn)可以非常相似并與回文或半回文DNA序列(I-CreI)結(jié)合，或者它們可以是非回文(I-SceI)。

內(nèi)含子編碼的核酸內(nèi)切酶I-SceI

? ? ? ? 內(nèi)含子編碼的核酸內(nèi)切酶I-SceI是歸巢核酸內(nèi)切酶。該酶在生物技術(shù)中用作歸巢核酸內(nèi)切酶。它識(shí)別一個(gè)18個(gè)堿基對(duì)的序列TAGGGATAACAGGGTAAT，并留下一個(gè)4個(gè)堿基對(duì)的3'羥基突出端。對(duì)核酸內(nèi)切酶來(lái)說(shuō)，這是一種罕見(jiàn)的切割。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)研究，每6.9x10^10個(gè)堿基對(duì)將出現(xiàn)一次18bp的序列(出現(xiàn)概率為1/4^18)。該序列通常不會(huì)在人類或小鼠基因組中出現(xiàn)。I-SceI由內(nèi)含子編碼，它存在于釀酒酵母的線粒體中。

基因編輯的工具

? ? ? ? 歸巢核酸內(nèi)切酶的高特異性使其比其他天然限制酶具有更高的精確度和更低的細(xì)胞毒性。大范圍核酸酶在1990年代被鑒定出來(lái)，隨后的工作表明它們是基因組工程和基因編輯的特別有前途的工具，因?yàn)樗鼈兡軌蛴行У卣T導(dǎo)同源重組，產(chǎn)生突變，和改變閱讀框架。

? ? ? ? 但是，可以進(jìn)行的歸巢核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)的基因重組受到可用歸巢核酸內(nèi)切酶組成的限制。盡管自然界中存在數(shù)百種歸巢核酸內(nèi)切酶，而且每個(gè)都可以忍受其識(shí)別位點(diǎn)的微小變化，但發(fā)現(xiàn)能夠在所需位置切割給定基因的歸巢核酸內(nèi)切酶的可能性非常小。幾個(gè)小組將注意力轉(zhuǎn)移到了工程化針對(duì)目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)的新的歸巢核酸內(nèi)切酶上。

? ? ? ? 最先進(jìn)的研究和應(yīng)用涉及LAGLIDADG家族的歸巢核酸內(nèi)切酶。

? ? ? ? 為了創(chuàng)建量身定制的大范圍核酸酶，已采用了兩種主要方法：

1.通過(guò)在氨基酸序列中引入少量變異，然后在自然識(shí)別位點(diǎn)的變異中選擇功能性蛋白質(zhì)，來(lái)修飾現(xiàn)有大范圍核酸酶的特異性。

2.更根本的選擇是開(kāi)發(fā)一種在歸巢核酸內(nèi)切酶天然高度多樣化中發(fā)揮重要作用的特性：將不同酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域關(guān)聯(lián)或融合的可能性。此選項(xiàng)使開(kāi)發(fā)具有新識(shí)別位點(diǎn)的嵌合歸巢核酸內(nèi)切酶成為可能，該新識(shí)別位點(diǎn)由歸巢核酸內(nèi)切酶A的半位點(diǎn)和蛋白質(zhì)B的半位點(diǎn)組成。通過(guò)融合I-DmoI和I-CreI的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)嵌合歸巢核酸內(nèi)切酶具有使用以下方法創(chuàng)建的：E-Drel和DmoCre。

? ? ? ? 可以結(jié)合使用這兩種方法來(lái)增加創(chuàng)建新酶的可能性，同時(shí)保持高度的功效和特異性。自1999年以來(lái)，Cellectis的科學(xué)家一直在進(jìn)行基因編輯，并從同型二聚體歸巢核酸內(nèi)切酶I-CreI以及其他歸巢核酸內(nèi)切酶支架中開(kāi)發(fā)了超過(guò)20,000個(gè)蛋白質(zhì)域?？梢詫⑺鼈兘M合形成功能性的嵌合量身定制的異二聚體，用于研究實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)用途。

? ? ? ? 另一家生物技術(shù)公司Precision Biosciences已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一種完全合理的設(shè)計(jì)過(guò)程，稱為定向核酸酶編輯器(DNE)，它能夠創(chuàng)建靶向并修飾基因組中用戶定義位置的工程化歸巢核酸內(nèi)切酶。2012年，拜耳作物科學(xué)公司(Bayer CropScience)的研究人員使用DNE將基因序列整合到棉花的DNA中，將其精確地靶向預(yù)定位點(diǎn)。

其他應(yīng)用

? ? ? ? 使用歸巢核酸內(nèi)切酶進(jìn)行基因組工程的最新進(jìn)展是將轉(zhuǎn)錄激活因子樣(TAL)效應(yīng)子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域并入雜交核酸酶。這些“megaTAL”將TAL效應(yīng)子的易加工性和高DNA結(jié)合特異性與大范圍核酸酶的高切割效率相結(jié)合。此外，大范圍核酸酶已與DNA末端加工酶融合，以促進(jìn)容易出錯(cuò)的非同源末端連接，并增加給定基因座上誘變事件的頻率。

可能性

? ? ? ?如開(kāi)篇所述，具有18個(gè)堿基對(duì)序列的歸巢核酸內(nèi)切酶平均需要一次偶然發(fā)現(xiàn)一次人類基因組大小二十倍的基因組。計(jì)算公式為4^18/3x10^9 = 22.9。但是，非常相似的序列更為常見(jiàn)，隨著頻率的提高，允許的錯(cuò)配越多。

例如，除一個(gè)堿基對(duì)外，所有序列都相同的序列平均每4^17/18x3x10^9 = 0.32個(gè)人類基因組當(dāng)量就會(huì)出現(xiàn)一次，或者每個(gè)人類基因組出現(xiàn)3次。平均而言，除了兩個(gè)堿基對(duì)之外，所有其他序列均相同的序列每4^16/(18C2)x3x10^9 = 0.0094個(gè)人類基因組當(dāng)量平均發(fā)生一次，或每個(gè)人類基因組107次。

? ? ? ?這很重要，因?yàn)槊笡](méi)有完美的區(qū)分能力。即使序列不完全匹配，核酸酶仍會(huì)起作用。因此，核酸酶在一個(gè)錯(cuò)配序列上的活性小于無(wú)錯(cuò)配情況，而對(duì)于兩個(gè)錯(cuò)配，其活性甚至更低，但仍不為零。這些非常相似但不完全相同的序列的排除仍然是基因組工程中需要克服的重要問(wèn)題。